HIV-1p24ELISA检测试剂盒及其使用方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及IPCG01N33领域，更具体地，涉及一种HIV

【技术实现步骤摘要】
HIV
‑
1 p24 ELISA检测试剂盒及其使用方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及IPCG01N33领域，更具体地，涉及一种HIV
‑
1 p24 ELISA检测试剂盒及其使用方法与应用。

技术介绍

[0002]p24是HIV病毒颗粒的主要结构蛋白，是结构基因gag的产物，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用。p24蛋白的氨基酸序列在HIV各类型质检中高度保守，缺失p24会导致病毒无法正常组装。
[0003]慢病毒载体是在HIV
‑
1病毒基础上改造而生成的病毒载体系统，慢病毒可高效地将目的基因转入相关细胞中。p24蛋白的含量代表着慢病毒的颗粒数。免疫分析法(ELISA)是行业内检测慢病毒物理滴度(p24蛋白)的首选方法。
[0004]常规的ELISA实验操作需要提前一天进行板子包被，以及其他检验试剂的配制，时间周期长，且提前准备工作复杂，工作量大。且ELISA检测实验受环境、人员操作影响较大，常规操作，整个物料准备、检测过程复杂，且出错率高，常常会因为样品数量大而出现样品与样品之间混淆，加样时孔与孔之间重复或者跳孔等。该试剂盒的目的在于提供一款ELISA检测测定试剂盒，里面已包含包被好的板子，配置好的试剂。可改善现有实验检测操作中存在的复杂操作，出错率高等不足，解决前期准备工作繁琐的技术问题，便于实验的顺利开展，得到更可靠、准确的数据。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术第一方面，提供了一种HIV
‑
1 p24ELISA检测试剂盒，包括：包被酶标板、检测抗体、酶结合物、标准品、裂解液、检测抗体和酶结合物稀释液、样品稀释液、20
×
PBST洗液、底物显色液A、底物显色液B、终止液。
[0006]优选的，所述包被酶标板由HIV
‑
1p24特异性单克隆抗体包被。
[0007]优选的，所述HIV
‑
1p24特异性单克隆抗体由P
‑
AB
‑
1和P
‑
AB
‑
2两种抗体组成。
[0008]优选的，所述P
‑
AB
‑
1和P
‑
AB
‑
2的浓度比为(1
‑
2)：(1
‑
2)；进一步优选的，为1:1。
[0009]申请人意外发现，选用浓度比为(1
‑
2)：(1
‑
2)的P
‑
AB
‑
1和P
‑
AB
‑
2两种抗体组成的HIV
‑
1p24特异性单克隆抗体应用于包被酶标板中，不仅可以减少试剂盒的检测时间，还能提高试剂盒的精密度。这可能是由于传统的双抗夹心法检测样本中HIV
‑
1p24蛋白，只采用一种HIV
‑
1p24特异性单克隆抗体预包被，检测时间长，且精密度低。申请人意外发现选用(1
‑
2)：(1
‑
2)的P
‑
AB
‑
1和P
‑
AB
‑
2两种抗体组成的HIV
‑
1p24特异性单克隆抗体应用于包被酶标板中，不仅提高了其特异性，使得其精密度更高，而且两种抗体协同作用，加快了反应速度，从而减少了试剂盒的检测时间，但是其会使得背景太高，影响特异性染色颜色的呈现。
[0010]在一些优选的方案中，所述P
‑
AB
‑
1和P
‑
AB
‑
2可为市售，例如供应商abcam公司的ab32352和ab63958。
[0011]优选的，所述包被酶标板的制备方法为：使用包被缓冲液将HIV
‑
1p24特异性单克
隆抗体稀释后得混合包被，每孔加入100μL混合包被4℃过夜；倒掉各孔内液体，用清洗液(350μL/孔)清洗微孔3次之后，每孔中加入200μL封闭液，37℃温箱放置1.5h；倒掉各孔内液体，用清洗液微孔3次之后，在面巾纸上拍干；每孔中加入200μL保存剂，37℃反应1h后，倒掉各孔内液体，在面巾纸上拍干并干燥，即得。
[0012]在一些优选的方案中，所述包被缓冲液可为市售，例如供应商上海酶联生物科技有限公司生产的ELISA包被缓冲液(1
×
)。
[0013]优选的，所述包被缓冲液与抗体的浓度比为1:(2000
‑
4000)。
[0014]优选的，所述清洗液的制备方法为：取适量20
×
PBST洗液用去离子水1：20稀释后即得。
[0015]在一些优选的方案中，所述20
×
PBST洗液可为市售，例如供应商北京中检葆泰生物技术有限公司生产的PBST洗涤缓冲液。
[0016]在一些优选的方案中，所述封闭液可为市售，例如供应商英创生物科技生产的封闭缓冲液。
[0017]在一些优选的方案中，所述保存剂可为市售，例如供应商上海酶联生物科技有限公司生产的蔗糖溶液(10％)。
[0018]优选的，所述检测抗体为生物素标定的p24抗体。
[0019]在一些优选的方案中，所述检测抗体可为市售，例如供应商例如供应商abcam公司的ab68617。
[0020]优选的，所述酶结合物为辣根过氧化物酶HRP标记链霉亲和素(亲和素
‑
HRP)。
[0021]在一些优选的方案中，所述酶结合物可为市售，例如供应商JacksonlmmunoResearch公司生产的016
‑
030
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084，产品浓度为1mg/mL。
[0022]优选的，所述标准品为含HIV
‑
1p24抗原的人血清。
[0023]所述标准品为市面上常见的含HIV
‑
1p24抗原的人血清，对购买厂家不做具体限制。
[0024]优选的，所述裂解液为0.1％SDS、0.1vol％Triton中的一种或多种；进一步优选的，为0.1vol％Triton。
[0025]申请人意外发现，选用Triton作为裂解液，可以溶解生物膜中的脂质成分，从而使得抗原能够与抗体结合。特别地，当Triton浓度为0.1％时，不仅可以保持好的裂解效果，还能降低背景，提高特异性颜色的呈现。
[0026]优选的，所述0.1vol％Triton的制备方法为：将50μL的Ttiton
‑
100与50mL的PBS混合，0.22μm滤膜过滤后即得，在4℃保存即可。
[0027]在一些优选的方案中，所述Ttiton
‑
100可为市售，例如供应商Sigma公司生产的9002
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HIV
‑
1p24ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：包被酶标板、检测抗体、酶结合物、标准品、裂解液、检测抗体和酶结合物稀释液、样品稀释液、20
×
PBST洗液、底物显色液A、底物显色液B、终止液；所述包被酶标板由HIV
‑
1p24特异性单克隆抗体包被；所述检测抗体为生物素标定的p24抗体；所述酶结合物为辣根过氧化物酶HRP标记链霉亲和素；所述标准品为含HIV
‑
1p24抗原的人血清；所述裂解液为0.1％SDS、0.1vol％Triton中的一种或多种；所述检测抗体和酶结合物稀释液为20vol％CSBuffer和3％BSA
‑
PBS中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的一种HIV
‑
1p24 ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述HIV
‑
1p24特异性单克隆抗体由P
‑
AB
‑
1和P
‑
AB
‑
2两种抗体组成。3.根据权利要求1或2所述的一种HIV
‑
1p24 ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被酶标板的制备方法为：使用包被缓冲液将HIV
‑
1p24特异性单克隆抗体稀释后得混合包被，每孔加入100μL混合包被4℃过夜；倒掉各孔内液体，用清洗液清洗微孔3次之后，每孔中加入200μL封闭液，37℃温箱放置1.5h；倒掉各孔内液体，用清洗液微孔3次之后，在面巾纸上拍干；每孔中加入200μL保存剂，37℃反应1h后，倒掉各孔内液体，在面巾纸上拍干并干燥，即得。4.根据权利要求3所述的一种HIV
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1p24 ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液与抗体的浓度比为1:(2000
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4000)。5.根据权利要求3或4所述的一种HIV
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1p24 ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述清洗液的制备方法为：取适量20
×
PBST洗液用去离子水1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽美，李查，张天扬，凡鹏程，郑孟韬，蔡宇卿，
申请(专利权)人：江苏谱新生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：