一种同时检测血液样品中三种蛋白结合类毒素含量的方法技术

本发明专利技术属于蛋白结合类毒素检测技术领域，本发明专利技术提供了一种同时检测血液样品中三种蛋白结合类毒素含量的方法。本发明专利技术方法包括制备供试品溶液、制备系列混合对照品溶液、对所述系列混合对照品溶液进行高效液相色谱测定、绘制硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测血液样品中三种蛋白结合类毒素含量的方法


[0001]本专利技术涉及蛋白结合类毒素检测
，尤其涉及一种同时检测血液样品中三种蛋白结合类毒素含量的方法。

技术介绍

[0002]尿毒症毒素是指肾功能衰竭时在体内储留的、具有特定生化或生物学活性的物质，在正常情况下能通过健康肾脏排泄。目前通常根据分子量和蛋白结合情况将尿毒症毒素分为三大类：(1)小分子水溶性毒素，分子量小于0.3kD，如尿素等；(2)中大分子类毒素，分子量多在0.3～12kD，主要是肽类和细胞因子；(3)蛋白结合类毒素(protein
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bound uremic toxins,PBUT)。如硫酸对甲酚(p
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cresol sulfate,PCS)、硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)、3
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吲哚乙酸(3
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indoleacetic acid,3
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IAA)等。
[0003]PBUT通常为低分子量化合物，因其可与血浆蛋白(主要是白蛋白)紧密结合后分子量可达66kD，被归类于尿毒症毒素中的高分子量化合物，即蛋白结合类毒素(protein
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bounduremic toxins,PBUTs)，因此这组毒素很难用常规的血液透析方法清除。PCS是一种原型蛋白结合的尿毒症毒素，起源于肠道，肠道细菌将芳香族氨基酸(如酪氨酸和苯丙氨酸)代谢成酚类代谢物，后经肝脏硫酸化形成。PCS水平已被证明可以预测慢性肾脏病患者的临床结果并与其心血管和全因死亡率相关。吲哚和吲哚衍生物由色氨酸代谢产生，肠道微生物色氨酸酶首先将色氨酸转化为吲哚，后被输送到肝脏，吲哚在肝脏中被硫酸转移酶硫酸化形成IS。3
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IAA直接在肠道或通过色胺在组织中代谢产生。这些色氨酸代谢物是转录因子芳基烃受体的内源性配体，与各种调节和信号蛋白相互作用。芳基烃受体的激活介导心脏毒性，血管炎症以及血管细胞的促凝血和促氧化表型。越来越多的证据表明，PBUTs在尿毒症的各种病理特征中起重要作用。
[0004]目前，硫酸对甲酚和硫酸吲哚酚是研究最深最广泛的PBUTs，两者的检测方法包括超高效液相色谱
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质谱联用、高效液相色谱法，其中高效液相色谱法包括荧光检测法与紫外检测法。3
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吲哚乙酸通常使用紫外检测法测定。超高效液相色谱
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质谱联用的检测方法受成本与检测条件的限制，应用并不广泛；现有的文献通常为单一成分检测。如文献《HPLC
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FLU法测定人血清中硫酸吲哚酚浓度及其在血液透析病人中的应用》中应用荧光检测器测定了硫酸吲哚酚的浓度，成分单一；文献《Determination ofuremic solutes in biological flfluids ofchronic kidney disease patients by HPLC assay》中虽然使用荧光检测器测定了苯酚、对甲酚、3
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吲哚乙酸、硫酸吲哚酚的浓度，但方法设置不同的检测波长，需多次进样；文献《Protein
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bound uremic toxins in hemodialysis patients measured by liquid chromatography/tandem mass spectrometry andtheir effects on endothelial ROS production》应用液质联用的方法检测血液样品中的硫酸吲哚酚、羟基葡萄糖醛酸酯、吲哚乙酸、硫酸对甲酚、对甲基葡萄糖醛酸酯、苯基硫酸盐、葡糖醛酸苯酚甙、苯乙酸、苯乙酰谷氨酰胺、马尿酸、4
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乙基苯基硫酸盐、3
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羧基
‑4‑
甲基
‑5‑
丙基
‑2‑
呋喃丙酸的含量，图谱显示各成分不能有效分离。

技术实现思路

[0005]为克服现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术提供了一种能更快速、简便、准确的同时检测血液样品中硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸含量的方法，以实现临床对3种蛋白结合类毒素的监测管理，可有效提高临床研究和大批量样本调查对比的效率。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种同时检测血液样品中三种蛋白结合类毒素含量的方法，包括如下步骤：
[0008](1)将血液样品与甲醇混合后，离心，取上清液为供试品溶液；
[0009](2)将硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸与甲醇混合，得混合对照品溶液，再将混合对照品溶液逐级用甲醇稀释，得系列混合对照品溶液；
[0010](3)对所述系列混合对照品溶液进行高效液相色谱测定，记录系列混合对照品溶液中硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸的色谱峰面积，以系列混合对照品溶液的浓度为横坐标，以相对应浓度所测得的色谱峰面积为纵坐标，分别绘制硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸的含量标准曲线；
[0011](4)对所述供试品溶液进行高效液相色谱测定，记录供试品溶液中硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸的色谱峰面积，然后通过步骤(3)绘制的含量标准曲线分别计算出供试品溶液中硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸的含量。
[0012]优选的，步骤(1)中所述血液样品与甲醇的混合体积比为1:1～5。
[0013]优选的，步骤(1)中所述离心的温度为4～8℃，所述离心的转速为3000～6000rpm，所述离心的时间为30～50min。
[0014]优选的，步骤(2)所述混合对照品溶液中，硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸的终浓度独立为350～450μg/mL。
[0015]优选的，步骤(2)所述系列混合对照品溶液中，硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸的终浓度独立为4～6μg/mL、8～12μg/mL、24～26μg/mL、48～52μg/mL、98～102μg/mL。
[0016]优选的，步骤(3)和步骤(4)中所述高效液相色谱测定的条件独立为：
[0017]流动相中0.1vt％三氟乙酸水溶液为A成分，乙腈为B成分；
[0018]梯度洗脱条件为：0～8min，85％A；8～18min，85％A
→
65％A；18～23min，65％A
→
85％A；23～28min，85％A；
[0019]检测波长为200～220nm；
[0020]流速为0.8～1.2mL/min；
[0021]柱温为25～35℃。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0023]1、本专利技术通过对高效液相色谱方法进行优化，建立了一种能同时检测硫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测血液样品中三种蛋白结合类毒素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将血液样品与甲醇混合后，离心，取上清液为供试品溶液；(2)将硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸与甲醇混合，得混合对照品溶液，再将混合对照品溶液逐级用甲醇稀释，得系列混合对照品溶液；(3)对所述系列混合对照品溶液进行高效液相色谱测定，记录系列混合对照品溶液中硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸的色谱峰面积，以系列混合对照品溶液的浓度为横坐标，以相对应浓度所测得的色谱峰面积为纵坐标，分别绘制硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸的含量标准曲线；(4)对所述供试品溶液进行高效液相色谱测定，记录供试品溶液中硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸的色谱峰面积，然后通过步骤(3)绘制的含量标准曲线分别计算出供试品溶液中硫酸对甲酚、硫酸吲哚酚、3
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吲哚乙酸的含量。2.根据权利要求1所述的一种同时检测血液样品中三种蛋白结合类毒素含量的方法，其特征在于，步骤(1)中所述血液样品与甲醇的混合体积比为1:1～5。3.根据权利要求1所述的一种同时检测血液样品中三种蛋白结合类毒素含量的方法，其特征在于，步骤(1)中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑玉林，裴新颖，刘丽娟，
申请(专利权)人：上海峰林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：