一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法技术

本发明专利技术涉及一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法，包括卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠模型的构建、卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨的获取、从卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨中分离骨髓液、提取脂质以及气相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法


[0001]本专利技术属于生物样本脂肪酸检测
，特别涉及一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法。

技术介绍

[0002]骨质疏松是以骨量减少、骨微结构破坏为特征，致使骨的脆性增加、易于发生骨折的一种全身代谢性骨病。老年人尤其是绝经后女性罹患骨质疏松导致脆性骨折事件的概率急剧攀升，大大增加了医疗及家庭社会的支出成本，骨质疏松的防治已成为目前迫切需要解决的公共健康问题。大量研究表明骨质疏松在骨矿物质密度降低的同时伴随骨髓脂肪组织增加，骨髓脂肪细胞不仅仅填充扩大的骨小梁间隙，而且为骨髓提供必要的能量需求和稳定的骨髓微环境。最近的研究进一步表明骨髓脂肪细胞通过自分泌和旁分泌功能释放一系列蛋白、细胞因子、脂肪酸等，骨髓微环境中的脂肪酸可以调节涉及骨细胞生长、分化、炎症和凋亡过程的各种关键信号通路，激活/表达骨稳态中起重要作用的不同核转录因子，影响邻近骨细胞的存活与功能，最终可能触发骨质疏松。
[0003]既往大多数有关骨质疏松的代谢组学研究都分析了生物体血液(血清或血浆)的脂质代谢包括脂肪酸的变化，但是由于血液中脂肪酸含量检测技术在实际应用中存在较大不足，如各实验室的分析方法不一样、定量方法未统一、没有使用标定的质量控制物质校正结果、未对脂肪酸做甲酯化处理等，因此各个研究结果的可靠性较难评判。有学者最近对比研究了37名绝经后女性的髂嵴穿刺骨髓样本的骨髓上清液中的脂肪酸和血浆中的脂肪酸，结果表明，骨髓液中的脂肪酸不同于血液的脂肪酸，它包含了骨髓微环境中由骨细胞提供的脂肪酸和由血液循环主动提供的脂肪酸，能够准确反映骨骼的能量需求，暗示了骨髓微环境产生的脂质的重要性。骨髓液中脂肪酸的组成引起了研究者们的高度关注，成为研究热点，但由于骨髓液的获取相对繁琐而且骨髓液含量相对较少，因此，骨髓液的收集过程必须小心细致，同时采用灵敏的方法对骨髓液标本进行测定。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法，该方法能够便捷、准确、高效的提取检测卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液中的脂肪酸，是研究骨质疏松动物模型骨髓液中脂肪酸组成及其代谢途径的关键一步。
[0005]本专利技术提供了一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法，包括如下步骤：
[0006](1)构建两侧卵巢切除诱导大鼠骨质疏松模型，术后4
‑
12周处死大鼠，取出子宫分离大鼠两侧股骨，清除两侧股骨上的肌肉、筋膜，再用PBS液冲洗两侧股骨，置于培养皿中备用；(2)将股骨两端的骨端剪去约5mm，暴露骨髓腔，然后用PBS液冲洗股骨干骨髓腔、股骨骨
端，将含有骨髓的PBS冲洗液装入标记好的试管；将PBS液冲洗后的股骨干、股骨骨端一起放入装有氘化氯仿的试管中浸泡，进一步提取股骨残留骨髓脂质，获得含有骨髓脂质的氯仿冲洗液；
[0007](3)配制51种脂肪酸甲酯混标溶液；将含有骨髓的PBS冲洗液浓缩干燥为组织粉末，采用硫酸甲醇法对组织粉末、步骤(2)中的含有骨髓脂质的氯仿冲洗液进行甲酯化预处理；利用GC
‑
MS检测甲酯化预处理后的组织粉末、含有骨髓脂质的氯仿冲洗液样本，获得样本各组分总离子流色谱图，进而获得各组分峰面积，根据标准曲线方程计算得到脂肪酸含量，单位为μg/g。
[0008]所述步骤(1)中取一侧股骨装入冻存管后立即放入液氮中，次日行高空间分辨率Micro CT扫描，测定松质骨感兴趣区内有关骨微结构参数。
[0009]所述步骤(3)中的配制51种脂肪酸甲酯混标溶液具体为：用正己烷配置成1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL，2000μg/mL十个混合标准浓度梯度，其中浓度为各组分的总浓度。
[0010]所述步骤(3)中利用eppendorf 5305真空浓缩仪将骨髓PBS冲洗液浓缩干燥为组织粉末。
[0011]所述步骤(3)中GC
‑
MS色谱条件：色谱柱Thermo TG
‑
FAME毛细管柱；进样量1μL，分流比8:1；进样口温度250℃，离子源温度230℃，传输线温度250℃，四极杆温度150℃；程序升温起始温度80℃，保持1min；以20℃/min升至160℃，保持1.5min；以3℃/min升至196℃，保持8.5min；最后以20℃/min升至250℃，保持3min；载气为氦气，载气流速0.63mL/min；
[0012]MS条件：电子轰击电离源，SIM扫描模式，电子能量70eV。
[0013]有益效果
[0014]本专利技术能够便捷、准确、高效的提取检测卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液中的脂肪酸，是研究骨质疏松动物模型骨髓液中脂肪酸组成及其代谢途径的关键一步。本专利技术首先通过PBS冲洗股骨干骨髓腔、股骨骨端，获得大部分骨髓脂质，其次通过使用氘化氯仿对冲洗后的股骨干、股骨骨端进行浸泡，对未能冲洗下来的残留骨髓脂质进一步溶解、提取，减少大鼠股骨骨髓液中脂肪酸在提取过程中的丢失。本专利技术中的两个步骤操作简便易行，能够更加准确、有效地提取大鼠股骨骨髓液中的脂肪酸。
附图说明
[0015]图1为各组分总离子流色谱图；其中，上：空白；中：混标TIC图；下：样本。
具体实施方式
[0016]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0017]实施例1
[0018]本实施例提供了一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法，包括以下步骤：
[0019](1)卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠模型的构建：
[0020]构建两侧卵巢切除诱导大鼠绝经后骨质疏松模型。3月龄雌性SD大鼠经腹腔注射2％戊巴比妥钠(50mg/kg体重的剂量)进行麻醉，将麻醉后的雌性SD大鼠侧卧，用剃毛刀剃除雌性SD大鼠两侧下腹部的鼠毛，再用碘伏对雌性SD大鼠两侧下腹部皮肤消毒。用手术刀在雌性SD大鼠右侧髋关节水平上方约1cm处割开大鼠皮肤，然后依次切开脂肪组织、腹肌、腹膜，进入盆腔，沿输卵管找到右侧卵巢组织，以无菌手术线结扎输卵管及血管后切除右侧卵巢组织，再用无菌手术线缝合各层切口，关闭右侧盆腔，再次用碘伏消毒手术区域。使用上述相同方法切除雌性SD大鼠左侧卵巢组织。为了避免术后进一步感染，整个手术过程严格遵循无菌操作原则，所有雌性SD大鼠均谨慎缝合切口，且术后腹腔注射1mL哌拉西林他唑巴坦钠注射液。手术后的雌性SD大鼠常规饲养，自由饮水和进食。
[0021](2)卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨的获取：
[0022]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种卵巢切除术诱导骨质疏松大鼠股骨骨髓液脂肪酸的提取检测方法，包括如下步骤：(1)构建两侧卵巢切除诱导大鼠骨质疏松模型，术后4
‑
12周处死大鼠，取出子宫分离大鼠两侧股骨，清除两侧股骨上的肌肉、筋膜，再用PBS液冲洗两侧股骨，置于培养皿中备用；(2)将股骨两端的骨端剪去约5mm，暴露骨髓腔，然后用PBS液冲洗股骨干、骨髓腔、股骨骨端，将含有骨髓的PBS冲洗液装入标记好的试管；将PBS液冲洗后的股骨干、股骨骨端一起放入装有氘化氯仿的试管中浸泡，进一步提取股骨残留骨髓脂质，获得含有骨髓脂质的氯仿冲洗液；(3)配制51种脂肪酸甲酯混标溶液；将含有骨髓的PBS冲洗液浓缩干燥为组织粉末，采用硫酸甲醇法对组织粉末、步骤(2)中的含有骨髓脂质的氯仿冲洗液进行甲酯化预处理；利用GC
‑
MS检测甲酯化预处理后的组织粉末、含有骨髓脂质的氯仿冲洗液样本，获得样本各组分总离子流色谱图，进而获得各组分峰面积，根据标准曲线方程计算得到脂肪酸含量，单位为μg/g。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中取一侧股骨装入冻存管后立即放入液氮中，次日行高空间分辨率Micro CT扫描，测定松质骨感兴趣区内有...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琳，唐翠松，王思竹，汤光宇，诸静其，邱裕友，华婷，
申请(专利权)人：上海市第十人民医院，
类型：发明
国别省市：