一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因BTbv及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因BTbv及其应用，属于基因工程、合成生物学及生物智能技术领域，所述基因BTbv的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，本发明专利技术中通过对智能设计的基因文库筛选获得杀虫基因BTbv，其能够实现在玉米细胞中较高水平表达两种杀虫蛋白即Cry1Ab

【技术实现步骤摘要】
一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因BTbv及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程、合成生物学及生物智能
，尤其涉及一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因BTbv及其应用。

技术介绍

[0002]苏云金芽胞杆菌来源的各种杀虫蛋白及其人工改造的衍生蛋白是目前杀虫转基因农作物主要的杀虫功能性基因的主要来源。这些杀虫蛋白主要包含编码杀虫晶体蛋白(ICPs)的Cry类和Cyt类基因，以及编码营养期杀虫蛋白(Vip)的vip类基因。三类基因表达蛋白、杀虫机制及杀虫性不尽相同。通常认为Cry蛋白作用机制包括溶解、酶解活化、与受体结合、插入和形成孔道和离子通道等过程。在过去的几十年里，已确定数十种苏云金芽孢杆菌菌系及130多种编码的杀虫晶体蛋白。
[0003]上述杀虫基因在玉米、水稻、棉花等转基因杀虫种质的开发与利用中取得了显著成绩。然而，伴随着转基因作物的开发，田间害虫对不同类型的bt蛋白抗性也在不断进化。为防止转基因作物中杀虫基因在短时间内因害虫抗性进化而失效，通常选择将多个杀虫蛋白在同一个转基因植株中同时表达的方式来解决这一突出问题。采用的策略多是将不同杀虫转基因植株进行杂交和回交转育，或者构建多价杀虫基因的植物表达载体进行遗传转化。前者将花费大量的时间和人力资源，不利于快速开展转基因育种工作。尽管后者一定程度上解决了上述问题，但由于载体构建过程中每个基因的增加都需要引入独立的启动子和终止子等转录调控元件，存在着转基因安全隐患的增加而需要进行更多的安全性评估。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因BTbv及其应用，本专利技术不同以往编码单个杀虫蛋白的天然或人工改造基因，能够同时编码两种独立的杀虫蛋白Cry1Ab
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like和Vip3Aa
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like蛋白，有效提高杀虫活性和杀虫谱。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因BTbv，所述基因BTbv的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]优选的，所述基因BTbv是由LP4/2a自剪切肽介导的Cry1Ab
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like和Vip3Aa
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like两个杀虫蛋白共表达而成。
[0008]优选的，所述的LP4/2a自剪切肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述Cry1Ab
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like的氨基氨酸序列如SEQ ID No.3所示；所述Vip3Aa
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like的氨基氨酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0009]本专利技术还提供了一种含有上述基因BTbv的表达载体。
[0010]本专利技术还提供了一种上述基因BTbv或表达载体在培育杀虫转基因植株中的应用。
[0011]优选的，所述植株包括玉米。
[0012]优选的，所述虫包括鳞翅目害虫。
[0013]进一步优选的，所述鳞翅目害虫包括玉米螟、玉米粘虫、草地贪夜蛾和棉铃虫中的一种或多种。
[0014]相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0015]本专利技术提供了一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因BTbv及其应用，本专利技术中通过对智能设计的基因文库筛选获得杀虫基因BTbv，其能够实现在玉米细胞中较高水平表达两种杀虫蛋白即Cry1Ab
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like和Vip3Aa
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like蛋白，该基因BTbv不仅避免靶标害虫对其杀虫蛋白耐受性进化的风险，还能够有效提高杀虫活性和杀虫谱。此外，本专利技术的基因BTbv在转基因材料中的表达量高，因此能够更容易获得杀虫效果。
附图说明
[0016]图1为基于LP4/2a自剪切肽共表达多杀虫蛋白基因文库的建立示意图；
[0017]图2为外源蛋白在转基因玉米与玉米胚芽鞘无细胞表达系统中表达量比较的柱状与折线组合图；
[0018]图3为外源蛋白在转基因玉米与玉米胚芽鞘无细胞表达系统中表达量比较的箱型图；
[0019]图4为17种稀释后单克隆抗体对携带相应蛋白标签的杀虫蛋白的ELISA标准曲线图；
[0020]图5为文库中的杀虫蛋白高表达基因克隆的获得与BTbv基因优化及衍生图；
[0021]图6为智能设计基因BTbv基因及其衍生基因的植物表达载体结构图；
[0022]图7为智能设计基因BTbv基因及其衍生基因的瞬时转化表达量堆积图。
具体实施方式
[0023]本专利技术提供了一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因BTbv，所述基因BTbv的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0024]在本专利技术中，所述基因BTbv优选的是由LP4/2a自剪切肽介导的Cry1Ab
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like和Vip3Aa
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like两个杀虫蛋白共表达而成。进一步优选的，所述基因BTbv的核苷酸序列的第4～2496位为Cry1Ab
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like，第2497～2580位为LP4/2a自剪切肽，第2581～4479位为Vip3Aa
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like。本专利技术的基因BTbv提高了所表达的杀虫蛋白表达量。
[0025]本专利技术利用自剪切肽连接两个杀虫蛋白的氨基酸编码序列的智能设计策略，自剪切肽其序列在翻译过程中形成的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻，导致无法形成正常的肽链连接，而使得核糖体能继续翻译下游蛋白，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”的原理，实现在玉米细胞中，仅使用一个共同的启动子和终止子构建的单价基因表达框内实现两个杀虫蛋白的共表达。同时，由于将不同种类的杀虫蛋白进行组合、排列，可能这种智能设计基因在宿主细胞中的表达水平受到转录水平及转录后水平的基因表达调控影响。本专利技术结合不同杀虫蛋白编码基因随机重组文库的构建与无细胞模拟植物细胞表达水平及杀虫活性的分子实验高通量筛选，鉴定出具有高抗玉米螟、草地贪夜蛾、玉米粘虫、棉铃虫等主要害虫的候选基因，进一步优化并比较其与衍生基因在玉米瞬时转化获得的杀虫蛋白产物进行不同害虫的杀虫效果比较，从而获得较其杀虫候选基因显著具有高表达及高杀虫性的新型智能设计基因，即BTbv。
[0026]在本专利技术中，所述基因BTbv的制备方法包括以下步骤：
[0027]1)首先利用限制性内切酶介导的17种鳞翅目杀虫蛋白编码基因随机排列方式，实现智能设计的多蛋白共表达重组基因文库的构建；
[0028]2)通过玉米胚芽鞘无细胞表达系统实现对上述重组蛋白的无细胞表达，模拟上述基因在玉米细胞中的表达情况；
[0029]3)通过对上述的重组蛋白的定量和杀虫效果分析，选择最佳的候选基因，并进一步改造，去掉研发过程中的蛋白标签；
[0030]4)最终通过化学合成法对上述优化后的基因序列进行全基因合成，并插入到克隆载体中，进行保存。
[0031]本专利技术的基因BTbv遴选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码两种杀虫蛋白的智能设计基因BTbv，其特征在于，所述基因BTbv的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的基因BTbv，其特征在于，所述基因BTbv是由LP4/2a自剪切肽介导的Cry1Ab
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like和Vip3Aa
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like两个杀虫蛋白共表达而成。3.根据权利要求2所述的基因BTbv，其特征在于，所述的LP4/2a自剪切肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述Cry1Ab
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like的氨基氨酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋新元，李新海，王云鹏，翁建峰，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：