shIL-27毕赤酵母高效表达基因及表达生产方法技术

本发明专利技术提供了shIL

【技术实现步骤摘要】
shIL
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27毕赤酵母高效表达基因及表达生产方法
专利
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[0001]本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及单链人白细胞介素
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27(shIL
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27)毕赤酵母高效表达基因以及相应表达生产方法的建立。

技术介绍
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[0002]1996年，Devergne等人发现了一种EB病毒调节的新的细胞基因EBI3，并提出EBI3以非共价的形式与p35或相关分子结合，形成一个分泌的异源二聚体。2002年，Pflanz通过数据库计算发现了一个长链四螺旋束细胞因子的新家族成员，通过SDS
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PAGE测定其摩尔质量为28，将其命名为p28。p28与EBI3结合形成可溶性异源二聚体，即白细胞介素
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27(IL
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27)。1998年，Sprecher等人成功克隆出新的Ⅰ型细胞因子受体，因其c端结构域包含高度保守的Trp
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Ser
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X
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Trp
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Ser(WSXWS)序列故命名为WSX
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1。它与IL
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6/IL
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12细胞因子信号转导受体家族成员IL
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12受体β1、IL
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12受体β2、白血病抑制因子受体、抑瘤素受体、gp130和粒细胞集落刺激因子受体具有结构同源性，揭示了WSX
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1在免疫应答调节中具有重要作用。随后，Chen等鉴定出T细胞细胞因子受体(T
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cell cytokine receptor,TCCR)(同WSX)，证实小鼠脾脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK cell)和巨噬细胞均表达TCCR。IL
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27可与受体WSX
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1单独结合却不足以传导信号。若WSX
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1和gp130组成受体复合体，与配体IL
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27结合，就可向下游传递信号，引起细胞效应。
[0003]IL
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27主要由抗原提呈细胞分泌，参与适应性免疫应答和固有免疫应答。IL
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27可促进幼稚CD4+T细胞的快速克隆扩增，IFN
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γ的产生及Th1分化，对适应性免疫反应具有重要的调节作用。在单核细胞、DC细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、肥大细胞中均发现WSX
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1和gp130共表达。先前的研究认为，IL
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27通过促进Treg细胞产生IL
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10发挥抗炎作用，或通过STAT1通路抑制Th17细胞的发育改善与Th17有关的炎性疾病。近年来的研究表明，中和内源性IL
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27会促进单核细胞产生炎性细胞因子。IL
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27通过抑制CD4+T细胞分泌INF
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γ，从而负向调节Ly6C+单核细胞向Tip
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DCs的分化，改善非洲锥虫感染过程中肝脏的炎症反应。IL
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27显著抑制肥大细胞的活化、降低炎症细胞因子的表达水平，改善肥大细胞介导的炎症反应。此外，免疫调节药瑞喹莫德(Resiquimod)减轻过敏性支气管哮喘的作用机制与IL
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27密切相关。瑞喹莫德刺激小鼠肺部的抗原提呈细胞分泌IL
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27，激活抗原提呈细胞分泌IFN
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γ从而抑制Th2细胞极化，并上调其表面的PDL
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1增强免疫耐受性，说明IL
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27在Th2细胞介导的过敏性哮喘中具有免疫保护作用。在淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染小鼠时，效应B细胞产生的IL
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27促进病毒特异性CD4+T细胞存活，维持滤泡辅助性T细胞功能。滤泡辅助性T细胞上的IL
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27R信号驱动产生IFN
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γ和IL
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21，产生抗病毒抗体促进对病毒感染的控制。IL
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27作用的靶细胞并非只有免疫细胞。近年来研究表明，IL
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27在黑色素瘤、慢性B淋巴细胞白血病、子宫内膜癌、前列腺癌和肺癌等肿瘤中表现出显著的抗肿瘤活性。实验证实IL
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27可以直接靶向小鼠皮下脂肪细胞，通过p38
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MAPK
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PGC
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1信号途径促进脂肪细胞产热，加快能量消耗，显著改善了小鼠的肥胖症状并提高了胰岛素敏感性。因此，IL
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27通过免疫调节发挥抗炎、抗病毒和抗肿瘤作用，还可以促进脂肪细胞产热，以减肥、改善肥胖及2型
糖尿病。
[0004]IL
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27的发现至今已有近20年，20年间研究者们对IL
‑
27的功能有了较深入的研究，发现其具有抗炎、抗病毒和抗肿瘤作用，还可以促进脂肪细胞产热，以减肥、改善肥胖及2型糖尿病等功能，但其高效制备问题仍未得到很好地解决，目前其制备主要使用哺乳动物细胞进行，产量低成本高，极大地限制了其实际开发和应用。

技术实现思路

[0005]针对以上问题：
[0006]本申请提供了一种shIL
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27毕赤酵母高表达基因，所述基因包含Kex2信号切割位点编码序列、IL
‑
27B的编码序列、linker序列和IL
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27A的编码序列。
[0007]进一步地，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
[0008]另一方面，本申请提供了高表达shIL
‑
27的毕赤酵母菌株，其中转入了上述基因。优选所述毕赤酵母菌株为毕赤酵母X
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33。
[0009]另一方面，本申请提供了上述菌株的制备方法，包括：
[0010]1)人工合成编码shIL
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27的DNA序列；
[0011]2)构建shIL
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27的表达盒；
[0012]3)构建表达载体；
[0013]4)表达与纯化shIL
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27蛋白；
[0014]5)鉴定shIL
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27，并检测其生物活性。
[0015]进一步地，所述表达盒包括Kex2信号切割位点编码序列、IL
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27B的编码序列、linker序列和IL
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27A的编码序列；所述表达盒核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
[0016]进一步地，所述表达载体为真核表达载体。
[0017]进一步地，所述表达载体为pPICZα。
[0018]另一方面，本申请提供了上述菌株在制备shIL
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27中的应用。
[0019]进一步地，所述应用中使用BMMY发酵培养上述菌株，发酵培养的起本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种shIL
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27毕赤酵母高效表达基因，其特征在于，所述基因包含Kex2信号切割位点编码序列、IL
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27B的编码序列、linker序列和IL
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27A的编码序列。2.根据权利要求1所述的基因，其中所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。3.高表达shIL
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27的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述毕赤酵母菌株中转入了根据权利要求1或2所述的基因。4.根据权利要求3所述的菌株的制备方法，包括：1)人工合成编码shIL
‑
27的DNA序列；2)构建shIL
‑
27的表达盒；3)构建表达载体；4)表达与纯化shIL
‑
27蛋白；5)鉴定shIL
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【专利技术属性】
技术研发人员：马杰，王伟，焦平，孙丹丹，赵赫，孟祥锋，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：