本发明专利技术提供了一种产琥珀酸的大肠杆菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术从餐厨垃圾有机肥堆放地的土壤中分离出具有耐噬菌体特性的埃希氏菌HB1，该菌株可厌氧发酵生产琥珀酸。对埃希氏菌HB1进行基因改造，得到埃希氏菌HB333，该用于厌氧发酵生产琥珀酸，96h内产生85.4g/L的琥珀酸，葡萄糖转化率可达90％，显著提高了琥珀酸的生产效率，同时该菌株发酵过程中无需添加酵母膏，降低了生产成本，而且通过基因改造，降低了琥珀酸发酵生产中乳酸、乙酸、甲酸、乙醇等副产物含量，减轻了下游琥珀酸产品纯化压力，而且埃希氏菌HB333具有抗噬菌体特性，适合工业化大规模生产。产。产。
【技术实现步骤摘要】
一种产琥珀酸的大肠杆菌及其构建方法和应用
[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种产琥珀酸的大肠杆菌及其构建方法和应用。
技术介绍
[0002]琥珀酸，被美国能源部列为十二种最有潜力大宗生物基化学品中的首位，在食品、化学、医药等领域有广泛的应用。生产琥珀酸的化学方法有石蜡氧化法、氯乙酸甲酯氰化水解法和五氧化二钒催化加氢法等，但是化学法生产琥珀酸的原料来自不可再生的石油资源。
[0003]为了摆脱以石油基为唯一原料生产化学品，可以选择植物来源的葡萄糖作为起始原料，利用工业微生物埃希氏菌发酵生产多种化学品，生物材料、药物中间体，例如氨基酸、有机酸、维生素等。因此，研究生物法生产琥珀酸，具有较好的应用前景。
[0004]然而，当以埃希氏菌株进行大规模发酵时，经常碰到噬菌体感染事件，扰乱了生产秩序，造成经济损失。当大肠杆菌感染噬菌体后，通常采用紫外光照射、甲醛熏蒸、菌种轮换等措施来保证生产的持续性。但这些应对措施耗时长、要求严格、成本高，无法从根本上解决噬菌体感染的问题。因此，筛选抗噬菌体的埃希氏起始菌株作为底盘细胞，对解决大规模发酵中噬菌体感染具有重要意义。
[0005]目前，以大肠杆菌为底盘细胞，通过基因工程改造宿主菌生产琥珀酸成为研究热点，例如张学礼等人改造的大肠杆菌HX024菌株，琥珀酸产量可达95.9g/L，刘立明等人改造的大肠杆菌FMME
‑
SuAP菌株，琥珀酸产量达到80g/L。分析已发表的文献和公开的专利，我们发现起始菌株生产琥珀酸的过程中会产生乳酸、甲酸、乙酸等副产物，目的产物琥珀酸的生产效率低，，而且起始菌株及基因工程改造后的衍生菌株不具有抗噬菌体的能力，不适于工业化大规模生产。
技术实现思路
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术从自然界筛选到一株抗噬菌体的埃希氏菌，以基因工程手段改造此埃希氏菌，通过敲除产生副产物的基因，获得一株抗噬菌体及高产琥珀酸的埃希氏菌株，具有重要的工业应用价值。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种抗噬菌体的埃希氏菌HB1，所述埃希氏菌HB1于2022年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221565，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。
[0009]第二方面，本专利技术提供了一种重组埃希氏菌的构建方法，对上述埃希氏菌HB1进行以下(1)
‑
(4)中的一种或几种基因改造：
[0010](1)敲除乳酸脱氢酶基因ldhA；
[0011](2)敲除醇脱氢酶基因adhE；
[0012](3)敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB；
[0013](4)敲除磷酸乙酰转移酶基因pta和/或乙酸激酶基因ackA。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，利用Red同源重组技术进行上述基因改造。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因改造包括：PCR扩增具有筛选与反筛选功能的cat
‑
sacB片段；将cat
‑
sacB片段整合到埃希氏菌HB1基因组中，筛选具有氯霉素抗性的转化子，并用PCR验证；筛选蔗糖不敏感转化子，完成目标基因敲除。
[0016]第三方面，本专利技术提供了利用上述重组埃希氏菌的构建方法制备得到的重组埃希氏菌。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，一种产琥珀酸的埃希氏菌HB332，通过对埃希氏菌HB1进行以下(1)
‑
(4)的基因改造获得：
[0018](1)敲除乳酸脱氢酶基因ldhA；
[0019](2)敲除醇脱氢酶基因adhE；
[0020](3)敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB；
[0021](4)敲除乙酸激酶基因ackA。
[0022]第四方面，本专利技术提供了一种产琥珀酸的埃希氏菌HB333，所述埃希氏菌HB333于2022年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221566，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。
[0023]第五方面，本专利技术提供了上述埃希氏菌HB1或重组埃希氏菌或埃希氏菌HB333在生产琥珀酸中的应用。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述生产琥珀酸的方法包括：在发酵培养基上发酵培养埃希氏菌HB1或重组埃希氏菌或埃希氏菌HB333。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养的方法为：将活化后的埃希氏菌HB1或重组埃希氏菌或埃希氏菌HB333以3
‑
6％的接种量接种至发酵培养基中，30
‑
40℃下进行厌氧发酵，发酵过程控制pH为7.0。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，发酵过程控制pH在7.0，所用中和剂为2.4mol/L碳酸钾和1.2mol/L氢氧化钾混合液(2.4M K2CO3溶解在1.2M KOH中)。
[0027]在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基为：含100g/L葡萄糖和100mM碳酸氢钾的无机盐培养基；
[0028]所述无机盐培养基为：NH4Cl 1g
·
L
‑1、KH2PO
4 0.5g
·
L
‑1、K2HPO
4 1.5g
·
L
‑1、MgSO40.2g
·
L
‑1、NaCl 1g
·
L
‑1、微量元素溶液2ml/L，pH7.0；
[0029]所述微量元素溶液为：CoCl2·
6H2O 0.1g
·
L
‑1、MnCl2·
4H2O 0.425g
·
L
‑1、ZnCl20.05g
·
L
‑1、NiCl2·
6H2O 0.01g
·
L
‑1、CuSO4·
5H2O 0.015g
·
L
‑1、Na2MoO4·
2H2O 0.01g
·
L
‑1、Na2SeO4·
2H2O 0.01g
·
L
‑1。
[0030]在本专利技术的一种实施方式中，所述埃希氏菌HB1或重组埃希氏菌或埃希氏菌HB333在种子培养基中活化，具体步骤包括：将埃希氏菌HB1、埃希氏菌HB332或埃希氏菌HB333单克隆接种到种子培养基中，37℃，180r
·
min
‑1振荡培养培养12h，获得种子液，用于发酵培养基接种；
[0031]其中，种子培养基为含50g/L葡萄糖和100mM碳酸氢钾的无机盐培养基；
[0032]所述无机盐培养基为：NH4Cl 1g
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L
‑1、KH2PO
4 0.5g
·
L
‑1、K2HPO
4 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗噬菌体的埃希氏菌HB1，其特征在于，所述埃希氏菌HB1于2022年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221565，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。2.一种重组埃希氏菌的构建方法，其特征在于，对权利要求1所述的埃希氏菌HB1进行以下(1)
‑
(4)中的一种或几种基因改造：(1)敲除乳酸脱氢酶基因ldhA；(2)敲除醇脱氢酶基因adhE；(3)敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB；(4)敲除磷酸乙酰转移酶基因pta和/或乙酸激酶基因ackA。3.利用权利要求2所述构建方法制备得到的重组埃希氏菌。4.一种产琥珀酸的埃希氏菌HB333，其特征在于，所述埃希氏菌HB333于2022年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221566，保藏地址为中国湖北武汉，武汉大学。5.权利要求1所述的埃希氏菌HB1或权利要求3所述的重组埃希氏菌或权利要求4所述的埃希氏菌HB333在生产琥珀酸中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生产琥珀酸的方法包括：在发酵培养基上发酵培养埃希氏菌HB1或重组埃希氏菌或埃希氏菌HB333。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵培养的方法为：将活化后的埃希氏菌HB1或重组埃希氏菌或埃希氏菌HB333以3
‑
6％的接种量接种至发酵培养基中，30
‑
40℃下进行厌氧发酵，发酵过程控制pH为7.0。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基为：含100g/L葡萄糖和100mM碳酸氢钾的无机盐培养基，所述无机盐培养基为：NH4Cl 1g
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L
‑1、KH2PO40.5g
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L
‑1、K2HPO
4 1.5g
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‑1、MgSO
4 0.2g
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L
‑1、NaCl 1g
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L
‑1、微量元素溶液2ml/L，pH7.0；优选地，所述微量元素溶液为：CoCl2·
6H2O 0.1g
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L
‑1、MnCl2·
4H2O 0.425g
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L
...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑华宝，姚臻豪，
申请(专利权)人：杭州欧合生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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