盐单胞菌及其在联产四氢嘧啶和聚羟基脂肪酸酯的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种盐单胞菌株Halomonas sp.YL01，通过以该菌株为底盘菌，采用分子手段过表达四氢嘧啶合成基因簇以及引入外源PHB合成途径，能够实现联产四氢嘧啶和聚羟基脂肪酸酯，并大幅提高两者的产量。并大幅提高两者的产量。并大幅提高两者的产量。

【技术实现步骤摘要】
盐单胞菌及其在联产四氢嘧啶和聚羟基脂肪酸酯的应用


[0001]本专利技术涉及合成生物
，具体涉及一种盐单胞菌及其在联产四氢嘧啶和聚羟基脂肪酸酯的应用。

技术介绍

[0002]四氢嘧啶是一种环状氨基酸衍生物，具有亲水性和两性离子特征，是典型的微生物相容溶质之一。它除了可以作为渗透压补偿性溶质平衡细胞内外的渗透压力外，还帮助细胞内的蛋白酶、核酸、生物膜甚至整个细胞对抗高温、冷冻、干燥、氧自由基辐射、尿素等变性剂的有害作用，并且还能够在细胞内协助蛋白质正确组装和折叠,担当分子伴侣的角色。由于四氢嘧啶具有强大的生物大分子(胞外多糖、酶、DNA和抗体等)和细胞稳定作用,能够保护细胞免受高渗透压及高温等极端环境的影响,因此在精细化工、环境治理、农业生物技术和生物医学等领域具有良好的应用潜力。
[0003]最早报道了盐单胞菌内存在天然合成四氢嘧啶的代谢途径。经过几十年的研究,四氢嘧啶的合成途径已在基因水平、酶水平和调控水平上有了较为深入的发展。在四氢嘧啶的所有合成代谢途径中,以赖氨酸生物合成途径中的天冬氨酸半醛(L
‑
aspartate
‑
B
‑
semialdehyde)为前体,依赖于进化高度保守的连锁ectABC基因簇操纵子。结构基因ectB、ectA和ectC分别编码L
‑
二氨基丁酸转氨酶(EctB)、L
‑
二氨基丁酸乙酰转移酶(EctA)和四氢嘧啶合酶(EctC)，经3步催化合成四氢嘧啶。
[0004]本申请专利技术人利用在进行盐湖淤泥采样后进行宏基因组测序分析，并通过序列比对筛选获得全新序列的ectABC基因簇，相对于传统的ectABC基因簇操纵子，其可以实现一步法催化合成四氢嘧啶，但是在产量方面还有很大的上升空间，专利技术人对ectABC基因簇进行突变设计，增强了活性，进一步提高了四氢嘧啶的转化效率，从而提高产量。
[0005]另一方面，聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是由很多细菌合成的一种胞内聚酯，在生物体内主要是作为碳源和能源的贮藏性物质而存在，它具有类似于合成塑料的物化特性及合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等许多优秀性能。聚羟基脂肪酸酯在可生物降解的包装材料、组织工程材料、缓释材料、电学材料以及医疗材料方面有广阔的应用前景。
[0006]专利技术人发现盐单胞菌Halomonas sp.YL01内自身存在PHA生物合成途径，主要通过乙酰辅酶A途径合成，它由两分子乙酰辅酶A依次经β
‑
酮基硫解酶(phaA)，经NADPH依赖的乙酰辅酶A还原酶(phaB)和PHB合成酶(phaC)的催化形成聚3
‑
羟基丁酸酯(poly
‑3‑
hydroxybutyrate,PHB)。然而，虽然含有上述生产PHA的代谢通路，但产率很低，限制了其产业化应用。
[0007]专利技术人进一步研究发现，在该盐单胞菌株Halomonas sp.YL01中，四氢嘧啶在胞外运输效果好，可以达到60％以上，因为这一优势，完全可以考虑同时实现四氢嘧啶和聚羟基脂肪酸酯的联产。因此，专利技术人考虑直接采用该盐单胞菌株Halomonas sp.YL01为底盘菌，联产四氢嘧啶和聚羟基脂肪酸酯，并通过过表达四氢嘧啶合成基因簇以及引入外源PHB合
成途径，同时提高这两种产物的收率，从而更好的实现四氢嘧啶和聚羟基脂肪酸酯大规模产业化。

技术实现思路

[0008]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种盐单胞菌株Halomonas sp.YL01，通过以该菌株为底盘菌，采用分子手段过表达四氢嘧啶合成基因簇以及引入外源PHB合成途径，能够实现联产四氢嘧啶和聚羟基脂肪酸酯，并大幅提高两者的产量。
[0009]基于此，本专利技术提供一种盐单胞菌株Halomonas sp.YL01在联产四氢嘧啶和聚羟基脂肪酸酯中的应用。
[0010]所述盐单胞菌株Halomonas sp.YL01，其保藏于广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)，保藏日期为2022年4月24日，保藏编号为GDMCC.No62420。
[0011]所述盐单胞菌株Halomonas sp.YL01包含基因簇ectABC，其至少包括3个基因，分别为：
[0012]ectA基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0013]ectB基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0014]ectC基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]本专利技术提供一种盐单胞菌株Halomonas sp.YL01
‑
1，通过在盐单胞菌株Halomonas sp.YL01上过表达ectABC基因簇获得。
[0016]本专利技术还提供一种盐单胞菌株Halomonas sp.YL01
‑
1的制备方法，其包括：
[0017]第一步，携带基因簇ectABC自杀质粒pRE112
‑
ectABC的构建；
[0018]第二步，自杀质粒pRE112
‑
ectABC转化至大肠杆菌S17
‑
1；
[0019]第三步，接合至底盘菌Halomonas sp.YL01，得到ectABC基因簇过表达的菌株，命名为Halomonas sp.YL01
‑
1。
[0020]本专利技术提供一种盐单胞菌株Halomonas sp.YL01
‑
2，通过在底盘盐单胞菌株Halomonassp.YL01
‑
1上采用PCT540基因异源表达获得。
[0021]本专利技术提供一种盐单胞菌株Halomonas sp.YL01
‑
2的制备方法，其包括：
[0022]第一步，自杀质粒pRE112
‑
PCT540的构建；
[0023]第二步，自杀质粒pRE112
‑
PCT540转化至大肠杆菌S17
‑
1；
[0024]第三步，接合至前述Halomonas sp.YL01
‑
1，得到PCT540基因异源表达表达的Halomonassp.YL01菌株，命名为Halomonas sp.YL01
‑
2。
[0025]本专利技术还提供一种联产四氢嘧啶及聚羟基脂肪酸酯的方法，其包括：
[0026]第一步，Halomonas sp.YL01
‑
2种子液的制备；
[0027]第二步，发酵液制备；
[0028]第三步，发酵培养，联产四氢嘧啶及聚羟基脂肪酸酯。
[0029]本专利技术具有的有益技术效果：提供一种盐单胞菌株Halomonas sp.YL01，通过以该菌株为底盘菌，采用分子手段过表达四氢嘧啶合成基因簇以及引入外源PHB合成途径，能够实现联本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种盐单胞菌株Halomonas sp.YL01在联产四氢嘧啶和聚羟基脂肪酸酯中的应用。2.如权利要求1所述的盐单胞菌的应用，其特征在于：所述盐单胞菌株Halomonas sp.YL01，其保藏于广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)，保藏日期为2022年4月24日，保藏编号为GDMCC.No62420。3.如权利要求1或2所述的盐单胞菌的应用，其特征在于：所述盐单胞菌株Halomonas sp.YL01包含基因簇ectABC，其至少包括3个基因，分别为：ectA基因，核酸序列如SEQ ID NO.1所示；ectB基因，核酸序列如SEQ ID NO.2所示；ectC基因，核酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.一种盐单胞菌株Halomonas sp.YL01
‑
1，其特征在于：通过在权利要求1所述的盐单胞菌株Halomonas sp.YL01上过表达ectABC基因簇获得。5.权利要求4所述盐单胞菌株Halomonas sp.YL01
‑
1的制备方法，其特征在于：包括：第一步，携带基因簇ectABC自杀质粒pRE112
‑
ectABC的构建；第二步，自杀质粒pRE112
‑
ectABC转化至大肠杆菌S17
‑
1；第三步，接合至底盘菌Halomonas sp.YL01，得到ectABC基因簇过表达的...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，请求不公布姓名，周明新，周振涛，
申请(专利权)人：深圳中科翎碳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：