固定二氧化碳电合成3-羟基丁酸的工程菌及构建方法技术

本发明专利技术提供了一种利用合成生物技术设计构建高效利用电能固定CO2并合成3

【技术实现步骤摘要】
固定二氧化碳电合成3
‑
羟基丁酸的工程菌及构建方法


[0001]本专利技术涉及合成生物
，具体涉及一种利用固定二氧化碳电合成3
‑
羟基丁酸的工程菌及构建方法。

技术介绍

[0002]微生物电催化过程通过电活性微生物与外界环境进行双向电子与能量交换，以实现环境、能源领域的广泛应用。生物电合成(Microbial electrosynthesis，MES)可直接利用电能驱动微生物还原固定CO2，合成多碳化合物，为可再生新能源转化、精细化学品制备和生态环境保护提供新机遇。但是，现有已知的微生物与电极间的胞外电子传递(Extracellular electron transfer，EET)速率较低，尚难以达到工业化要求；产生的有机化合物主要以C1和C2化合物为主，品位较低，商业价值不高。依赖于现代分子生物学和现代合成生物技术的生物工程，比如优化微生物胞外电子传递链和构建高附加值化合物的合成代谢途径，可提供解决上述两个主要问题的方案。
[0003]3‑
羟基丁酸是许多重要化合物的生产原料，如维生素、抗生素、激素以及香料物质的生产前提。同时该化合物也是生产生物降解塑料的重要原料 ,实现其工业化生产是治理“白色污染”、推动生物降解塑料研究、开发和应用的关键。传统的3
‑
羟基丁酸采用的都是化学合成法，随着绿色化工技术的不断发展，如何采用绿色低碳的第三代生物精炼技术实现传统化学合成法向生物合成法的转变，是行业研究的重点。专利技术人利用电能固定CO2并实现了异丙醇的生物合成方法，因此考虑采用第三代生物精炼合成方法替代传统的化学合成法，实现3
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羟基丁酸的绿色低碳生产路线。
[0004]有研究在菌株G. sulfurreducens中表达了Chlorobium limicola柠檬酸裂合酶基因，构建了G. sulfurreducens ACL（Toshiyuku Ueki, Kelly P.Nevin, Trevor L. Woodard, et al. 2018）工程菌株，申请人通过研究发现该菌株能直接利用电能固定CO2，而没有表达柠檬酸裂合酶的菌株G. sulfurreducens是没有利用电能固定CO2的能力。为开展微生物电能利用分子机制以及电合成研究提供了较为理想的底盘生物，本专利技术正式对该底盘生物进行合成生物设计，实现高效利用电能固定二氧化碳并通过微生物电合成方式转化为3
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羟基丁酸，实现该产品的绿色低碳制备。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是利用合成生物技术，通过利用G. sulfurreducens ACL底盘生物，通过合成生物学设计构建了高效利用电能固定CO2，并通过微生物电合成方法优化微生物还原性三羧酸循环途径关键步骤，构建高效合成3
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羟基丁酸的的合成代谢途径。
[0006]基于此，本专利技术提供一种利用合成生物技术设计构建高效利用电能固定CO2的工程菌的方法，其包括：以电合成菌株G.sulfurreducensACL为底盘过表达异柠檬酸脱氢酶与苹果酸脱氢酶，获得工程菌。
[0007]所述构建工程菌的方法进一步具体包括：第一步，在底盘菌G.sulfurreducensACL中稳定复制的表达载体pRK
‑ꢀ
Geo5
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ISODH，构建过表达异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的表达载体pRK
‑ꢀ
Geo5
‑
ISODH
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MD，进行质粒构建；第二步，将所构建的质粒通过接合转移转化到底盘菌G.sulfurreducensACL中。
[0008]本专利技术还提供采用上述构建方法构建的工程菌。
[0009]本专利技术还提供采用上述方法制备的工程菌实现高效利用电能固定CO2的方法，其包括：将前面制备的过表达异柠檬酸脱氢酶与苹果酸脱氢酶工程菌接种于H
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型微生物燃料电池的阴极，在阳极连续通入N2和CO2构成的混合气以给细菌细胞提供碳源，实现CO2的固定。
[0010]本专利技术还提供一种利用合成生物技术设计构建实现CO2转化为3
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羟基丁酸的工程菌的方法，以电合成菌株G.sulfurreducensACL为底盘过表达异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶以及3
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羟基丁酸合成途径相关酶，获得工程菌。
[0011]所述3
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羟基丁酸合成途径相关酶包括乙酰乙酰辅酶A合成酶、3
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羟基丁酰辅酶A脱氢酶以及3
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羟基丁酰辅酶A硫酯酶。
[0012]所述构建工程菌的方法进一步具体包括：第一步，在底盘菌G.sulfurreducensACL中稳定复制的表达载体pRK
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Geo2i，构建过表达异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶以及经密码子优化3
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羟基丁酸合成途径相关酶的表达载体pRK
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Geo2i
‑
HB
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ISODH
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MD，进行质粒构建；第二步，将所构建的质粒通过接合转移转化到底盘菌G.sulfurreducensACL中。
[0013]本专利技术还提供采用上述构建方法构建的工程菌。
[0014]本专利技术还提供了利用微生物电合成方法实现CO2合成3
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羟基丁酸的方法，其包括：将前面制备的工程菌接种到H
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型微生物燃料电池的阴极，在阳极连续通入混合气以给细菌细胞提供碳源，实现3
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羟基丁酸的合成。
[0015]本专利技术具有的有益技术效果：针对目前利用微生物电合成方法转化CO2为生物燃料生产过程中，转化效率低且产物特性差的问题。本专利技术根据合成生物学的原理,提供了一种设计构建了高效利用电能与CO2且合成3
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羟基丁酸的工程菌株的方法。将提高现有微生物生物电合成生产的效率实现CO2的高效转化。
附图说明
[0016]图1 本专利技术电活性微生物利用电能转化CO2为3
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羟基丁酸生化合成途径原理示意图；图2 本专利技术提供的pRK
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Geo5
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ISODH
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MD质粒图谱；图3 本专利技术提供的pRK
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Geo2i
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HB
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ISODH
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MD质粒图谱；图4 本专利技术提供的ACL、ACL
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ISODH、ACL
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ISODH
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MD以及 ACL
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ISODH
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SD 底盘菌株电能效率利用比较。
[0017]图5 本专利技术提供的ACL
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ISODH、ACL
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HB
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ISODH以及ACL
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HB
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建高效利用电能固定CO2的工程菌的方法，其包括：以电合成菌株G.sulfurreducensACL为底盘过表达异柠檬酸脱氢酶与苹果酸脱氢酶，获得工程菌。2.如权利要求1所述的构建高效利用电能固定CO2的工程菌的方法，其特征在于：进一步具体包括，第一步，在底盘菌G.sulfurreducensACL中稳定复制的表达载体pRK
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Geo5
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ISODH，构建过表达异柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的表达载体pRK
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Geo5
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ISODH
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MD，进行质粒构建；第二步，将所构建的质粒通过接合转移转化到底盘菌G.sulfurreducensACL中。3.采用权利要求1或2所述构建方法构建的工程菌。4.一种实现高效利用电能固定CO2的方法，其特征在于，包括：将权利要求3所述工程菌接种于H
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型微生物燃料电池的阴极，在阳极连续通入N2和CO2构成的混合气以给细菌细胞提供碳源，实现CO2的固定。5.一种构建实现CO2转化为3
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羟基丁酸的工程菌的方法，其特征在于：以电合成菌株G.sulfurreducensACL为底盘过表达异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶以及3
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羟基丁酸合成途径相关酶，获得工程菌。6.如权利要求5所述构建实现...

【专利技术属性】
技术研发人员：请求不公布姓名，谭扬，周明新，
申请(专利权)人：深圳中科翎碳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：