一种提高软骨素-4-O-磺基转移酶-1表达效率及酶活的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高软骨素

【技术实现步骤摘要】
一种提高软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1表达效率及酶活的方法


[0001]本专利技术涉及一种提高软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1表达效率及酶活的方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1(Chondroitin
‑4‑
O
‑
sulfotransferase
‑
1，C4ST
‑
1；又名Carbohydrate sulfotransferase 11，CHST11)，能够将来自3
’‑
磷酸腺苷
‑5’‑
磷酸硫酸盐(PAPS)的硫酸基团添加到不断增长的多糖链中，催化与GlcA相连的GalNAc的4号位羟基硫酸化生成硫酸软骨素A(CSA)。C4ST
‑
1在真核和原核宿主中的表达均有报道，最初是在哺乳动物细胞COS和CHO细胞中得以成功表达，康振等在毕赤酵母中实现了人源C4ST
‑
1的表达并具有一定酶活力，随后在毕赤酵母中实现了以甲醇为碳源全生物法合成硫酸软骨素；另外，Mattheos A.G.Koffas团队通过构建代谢路径在大肠杆菌K4菌株中首次实现了以原核细胞生产硫酸软骨素。以上都证明了异源表达人源C4ST
‑
1的可行性。
[0003]然而，人源C4ST
‑
1在微生物中的异源表达仍然存在诸多问题，在真核微生物中，如酵母中表达酶活力较低，而在原核生物中由于缺乏翻译后修饰，表达量过低。何文琴等设计了一个C4ST
‑
1构建体，以其糖基化和非糖基化形式在大肠杆菌和毕赤酵母中表达，大肠杆菌表达的C4ST
‑
1主要以不溶形式存在于包涵体中而毕赤酵母中的C4ST
‑
1具有更高的总转化率和优异的活性，但在存储时不稳定。而在原核中表达时，仍然采用促融标签、优化培养基组分、优化诱导条件(诱导剂浓度、诱导温度)等，但是效果有限，只能实现低浓度的可溶性表达。因此，需要开发新的提高C4ST
‑
1可溶性表达的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种有效简单、干扰性小且无需真核系统来实现人源磺基转移酶C4ST
‑
1高效表达及酶活力提高的方法，技术方案如下:
[0005]本专利技术提供了一种产人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1的重组大肠杆菌，是将人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1与分子伴侣通过质粒共表达。
[0006]在一种实施方式中，所述人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]在一种实施方式中，编码所述分子伴侣的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～8任一所示。
[0008]在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pET系列质粒、pRSFDuet系列质粒。
[0009]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌的宿主为E.coli Rosetta(DE3)。
[0010]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET32a(+)表达所述人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1，并以pRSFDuet
‑
1表达所述分子伴侣。
[0011]本专利技术还提供了应用所述重组大肠杆菌发酵生产人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1的方法。
[0012]在一种实施方式中，所述发酵是在TB培养基中发酵。
[0013]在一种实施方式中，利用IPTG诱导所述重组大肠杆菌产人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1。
[0014]在一种实施方式中，所述诱导是将所述重组大肠杆菌培养至OD
600
≥0.6。
[0015]在一种实施方式中，所述诱导是在25℃诱导。
[0016]在一种实施方式中，所述IPTG的浓度为50mg/L。
[0017]在一种实施方式中，所述诱导是将所述重组大肠杆菌培养至OD
600
达0.6，用终浓度为50mg/L的IPTG在25℃诱导。
[0018]本专利技术还提供所述分子伴侣在提高人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1胞外表达量方面的应用。
[0019]本专利技术还提供所述重组大肠杆菌或所述方法在生产硫酸软骨素或含硫酸软骨素的产品中的应用。
[0020]有益效果：与以往的原核系统表达人源磺基转移酶C4ST
‑
1的方法相比，本专利技术通过触发因子TF、二硫键氧化还原酶DsbC与DsbD、酵母来源的巯基氧化酶Erv1p和Ero1p、二硫键异构酶PDI等分子伴侣，与磺基转移酶共表达，提高了酶的可溶性表达，可使人源磺基转移酶C4ST
‑
1的酶活分别提高到了103.4U/L、56.25U/L、60.82U/L、77.2U/L、57.8U/L和98.2U/L，在20mg/mL底物情况下，硫酸化程度达到了72％、22.82％、50.14％、40％、45.78％和68.29％。并继续优化最优的共表达体系发酵条件，使得共表达分子伴侣TF的情况下C4ST
‑
1的酶活提高到了128.5U/L，硫酸化效率达到了78.5％。本方法只通过共表达的方式就实现了磺基转移酶酶活的大幅度提高，并且不影响酶的结构与后续纯化，为酶法生产硫酸软骨素提供了有效方法。
附图说明
[0021]图1为PNP的标准曲线。
[0022]图2为C4ST
‑
1单独表达或与分子伴侣共表达的蛋白的SDS
‑
PAGE图；其中，M：蛋白Marker；1：E.coli Rosetta(DE3)
‑
pRSF
‑
Duet
‑1‑
TF胞内上清；2：E.coli Rosetta(DE3)
‑
pRSF
‑
Duet
‑1‑
DsbC胞内沉淀；3：E.coli Rosetta(DE3)
‑
pRSF
‑
Duet
‑1‑
PDI胞内上清；4：E.coli Rosetta(DE3)
‑
pRSF
‑
Duet
‑1‑
PDI胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1的重组大肠杆菌，其特征在于，将人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1与分子伴侣通过质粒共表达；所述人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；编码所述分子伴侣的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～8任一所示。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述质粒包括但不限于pET系列质粒、pRSFDuet系列质粒。3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的宿主为E.coli Rosetta(DE3)。4.一种提高重组大肠杆菌胞外人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1产量的方法，其特征在于，将人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶
‑
1与分子伴侣通过质粒共表达；所述人源软骨素
‑4‑
O
‑
磺基转移酶<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张帆，刘立明，刘浩宇，宋伟，吴静，齐俊平，刘佳，
申请(专利权)人：衢州益康园生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：