一种表达低聚糖脱支酶的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达低聚糖脱支酶的基因工程菌及其应用，属于微生物工程技术领域。本发明专利技术提供了一种具有特定碱基序列的低聚糖脱支酶，并且成功的采用大肠杆菌对低聚糖脱支酶进行异源表达，采用本发明专利技术的方法，所表达的低聚糖脱支酶粗酶液的催化活力可达258.83U/mL。本发明专利技术提供的低聚糖脱支酶是一种新来源的低聚糖脱支酶，该来源在此前尚未报道过，具有较高比酶活，底物特异性强。本发明专利技术的低聚糖脱支酶能够脱支麦芽糊精中DP<6的短链段，填补了目前常用脱支酶底物特异性方面的空白，在淀粉糖、抗性淀粉、啤酒生产及乙醇燃料等工业领域中具有较高的潜在应用前景。中具有较高的潜在应用前景。中具有较高的潜在应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种表达低聚糖脱支酶的基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术涉及一种表达低聚糖脱支酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程和酶工程


技术介绍

[0002]淀粉是一种以α
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D
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葡萄糖为单体构成的天然高分子聚合物，分为直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉是由葡萄糖单元通过α
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1,4糖苷键构成的线性聚合物，支链淀粉以葡萄糖单元通过α
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1,4糖苷键构成其主链，再在分支点处以α
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1,6糖苷键连接不同数目葡萄糖单元构成其侧链，是一个具有复杂树枝形分支结构的大分子多糖。在淀粉加工过程中，一般需要多种淀粉酶对淀粉进行催化水解。水解α
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1,4糖苷键的酶包括α
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淀粉酶、糖化酶、β
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淀粉酶，然而这些酶不能或只能缓慢作用于α
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1,6糖苷键，限制了淀粉的水解速率。淀粉脱支酶能够专一、高效地水解支链淀粉中α
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1,6糖苷键，利用淀粉脱支酶与其他糖化酶协同作用，从而加速后续酶的反应，缩短反应时间，达到提高原料利用率及生产效率的目的。淀粉脱支酶目前已经被用于葡萄糖浆、高麦芽糖浆、环糊精、分支环糊精、焙烤、啤酒酿造和抗性淀粉等淀粉加工领域。
[0003]根据其底物特异性的不同，淀粉脱支酶可分为普鲁兰酶、异淀粉酶、糊精脱支酶和低聚糖脱支酶。普鲁兰酶对低分子量的糊精水解活力高，能够高效地水解普鲁兰多糖，对高分子量糊精以及分支密集的糖原水解活力低，最小作用底物单元为麦芽糖基麦芽糖。异淀粉酶适宜作用于较高分子量糊精、支链淀粉以及糖原，对小分子量的分支糊精水解活力较低，且不能水解普鲁兰多糖，底物的最小单位为麦芽三糖基麦芽四糖。糊精脱支酶对中等分子量大小的麦芽糊精水解活力高，低聚糖脱支酶对更小链段糊精或低聚糖水解活力高。
[0004]在淀粉制糖工业中，淀粉经过调浆液化后加入糖化酶从而产生不同的淀粉糖，在糖化过程中协同添加脱支酶可以提高转化率，然而现阶段工艺还存在一定不足。如在制备葡萄糖浆时添加的葡萄糖淀粉酶会催化葡萄糖发生聚合反应，生成异麦芽糖、潘糖等低聚异麦芽糖，在制备麦芽糖浆时添加的β
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淀粉酶不能作用于α
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1,6糖苷键而产生大量β
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极限糊精和其它寡糖。普鲁兰酶、异淀粉酶等脱支酶对此类小分子糊精及低聚糖的水解能力较弱，利用低聚糖脱支酶作用于此类较小的糊精及低聚糖，从而提高淀粉利用率，提高生产效率，并且减少副产物产生。
[0005]随着新型淀粉加工产品及工艺的不断创新发展，现代淀粉加工工业对淀粉脱支酶的性能提出了新的要求，包括不同的作用底物、不同的最适温度、高效性、稳定性等。因此，有必要开发新型的淀粉脱支酶，填补目前常用脱支酶底物特异性方面的空白，以适应更广泛的工业化生产的需求。

技术实现思路

[0006]为了解决上述存在的技术问题，本专利技术通过将来源于Paenibacillus sp.P22中编码低聚糖脱支酶的基因导入基因工程菌中实现低聚糖脱支酶的异源表达。
[0007]本专利技术提供了一种编码低聚糖脱支酶的基因，其基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术还提供了一种携带上述低聚糖脱支酶基因的重组载体。
[0009]本专利技术还提供了一种携带上述低聚糖脱支酶的基因，或上述重组载体的重组细胞。
[0010]本专利技术提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了来源于Paenibacillus sp.P22的低聚糖脱支酶，所述低聚糖脱支酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述低聚糖脱支酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET
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28a(+)为表达载体。
[0014]本专利技术还提供了上述重组大肠杆菌或氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的低聚糖脱支酶在水解麦芽糊精中的应用。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述低聚糖脱支酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0016]本专利技术还提供了一种水解麦芽糊精的方法，所述方法为：将上述重组大肠杆菌或其发酵制备得到的重组低聚糖脱支酶添加至含有麦芽糊精的反应体系中进行水解；或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的低聚糖脱支酶添加至含有麦芽糊精的反应体系中进行水解。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组低聚糖脱支酶是将重组大肠杆菌接种至种子培养基中，制备得到种子液，将种子液按照2％～4％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，在25～30℃下培养48～96h，制备得到重组低聚糖脱支酶粗酶液。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应体系的反应条件为：在45～55℃，pH 5.5～6.0的条件下反应24～36h。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应体系的反应条件为：在50℃，pH 6.0的条件下反应24h。
[0020]本专利技术还提供了上述重组大肠杆菌或氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的低聚糖脱支酶在制备水解麦芽糊精的产品中的应用。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述低聚糖脱支酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，利用发酵所得的重组低聚糖脱支酶粗酶液或经镍柱纯化后得到的纯酶于50℃水解麦芽糊精进行脱支反应。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述底物的浓度至少为10g/L。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述低聚糖脱支酶在反应体系中的加酶量至少为50U/g。
[0025]本专利技术还提供了上述基因，或上述重组载体，或上述重组大肠杆菌，或上述方法在水解麦芽糊精中的应用。
[0026]有益效果
[0027](1)本专利技术提供了一种具有特定碱基序列的低聚糖脱支酶，并且成功的采用大肠杆菌对低聚糖脱支酶进行异源表达，采用本专利技术的方法，所表达的低聚糖脱支酶粗酶液的催化活力可达258.83U/mL。
[0028](2)本专利技术的低聚糖脱支酶最适温度为50℃，在50℃保温60min后活性仍能保持在50％以上，且在45℃保温时酶活力出现激活现象，能够满足淀粉加工生产中对不同反应温度的需求。
[0029](3)本专利技术提供的低聚糖脱支酶是一种新来源的低聚糖脱支酶，该来源在此前尚未报道过，具有较高比酶活，底物特异性强。
[0030](4)本专利技术的低聚糖脱支酶能够脱支麦芽糊精中DP<6的短链段，填补了目前常用脱支酶底物特异性方面的空白，在淀粉糖、抗性淀粉、啤酒生产及乙醇燃料等工业领域中具有较高的潜在应用前景。
附图说明
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌表达了来源于Paenibacillus sp.P22的低聚糖脱支酶，所述低聚糖脱支酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述低聚糖脱支酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.如权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。4.如权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以pET
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28a(+)为表达载体。5.权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌或氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的低聚糖脱支酶在水解麦芽糊精中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，编码所述低聚糖脱支酶的核苷酸序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兆丰，张笑，李才明，班宵逢，顾正彪，程力，洪雁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：