一种阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量的方法及其相应的基因编辑藻株技术

本发明专利技术公开了一种阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量的方法，通过对编码C20脂肪酸延长酶的Δ5延长酶基因进行基因编辑，从而阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量，同时获得了一种不产DHA并富集EPA的工程藻株，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示。本发明专利技术通过对产油微藻Δ5延长酶(Elo5)进行基因编辑，阻断EPA进一步延长与去饱和合成DHA的代谢路径，同时实现积累更高相对含量EPA的目标。实现积累更高相对含量EPA的目标。

【技术实现步骤摘要】
一种阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量的方法及其相应的基因编辑藻株


[0001]本专利技术涉及藻类生物
，更具体地说是涉及一种编辑三角褐指藻Δ5延长酶基因以阻断其合成DHA并提高EPA相对含量的方法。

技术介绍

[0002]ω
‑
3超长链多不饱和脂肪酸(VLC
‑
PUFAs)因其在人类健康中的重要作用而受到越来越多的关注。二十碳五烯酸EPA(C20:5Δ
5,8,11,14,17
)和二十二碳六烯酸DHA(C22:6Δ
4,7,10,13,16,19
)是ω
‑
3VLC
‑
PUFAs中重要的成员，目前的主要来源为鱼油或者藻类。研究发现，鱼类并不是VLC
‑
PUFAs的真正生产者，绝大部分LC
‑
PUFAs首先是由海洋浮游植物合成的，再通过食物链传递被富集到鱼类等海洋动物中。培养海洋微藻生产ω
‑
3VLC
‑
PUFAs在理论上是一条更为直接的途径，也具有多个优势。一方面，海洋微藻可以快速生长繁殖、自身合成并富集高浓度的VLC
‑
PUFAs，某些微藻的VLC
‑
PUFAs含量可达到细胞干重的5％～6％，其相对含量远高于鱼体内VLC
‑
PUFAs的含量。另一方面，从藻体内提纯VLC
‑
PUFAs较鱼油中提取工艺简单，且不具有刺激性的腥味。此外，微藻中还不含胆固醇成分，避免了服用鱼油胶囊时摄入大量胆固醇的缺点。
[0003]从上世纪80年代以来，有关EPA的研究已深入到各个领域。有研究表明高纯度的EPA具有显著的降低患者血脂以及抗血栓效果。此外，EPA可转化为类二十烷，这是一组具有生物活性的化学物质，包括前列腺素、血栓素和白细胞三烯，在调节血压和凝血过程中发挥重要作用，并参与炎症和免疫反应等许多重要的生理过程。在近几年的报道中，EPA也可能在其他疾病包括类风湿性关节炎，肿瘤、结肠癌、阿尔茨海默病、帕金森病以及代谢综合征等疾病上发挥作用。
[0004]目前EPA主要是从鱼油中获取，但鱼油中还具有其他与EPA结构相似的VLC
‑
PUFAs，尤其是DHA，类似的结构使得EPA纯化的难度加大。由于EPA和DHA在药理作用上的存在差异，必须使用纯度更高的EPA来进行流行病学和临床试验。市场对高纯度EPA的需求量也不断增加。
[0005]三角褐指藻中EPA的相对含量可占其总脂肪酸的10％
‑
30％以上，是海洋藻类ω
‑
3超长链多不饱和脂肪酸合成研究的模式生物之一。三角褐指藻同样也能够合成DHA，其相对含量通常不超过总脂肪酸的5％。三角褐指藻虽然具备高含量EPA的优势，但极少量的DHA不仅对分离工艺要求更加高，也极大程度的增加了生产纯化成本。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量的方法及其相应的基因编辑藻株。本专利技术通过对产油微藻Δ5延长酶(Elo5)进行基因编辑，阻断EPA进一步延长与去饱和合成DHA的代谢路径，同时实现积累更高相对含量EPA的目标。
[0007]本专利技术为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
[0008]一种阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量的方法，其特征在于通过对编码C20脂肪酸延长酶的Δ5延长酶(Elo5)基因进行基因编辑，从而阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量。
[0009]进一步地，上述阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量的方法中，可以对Elo5基因进行基因敲除，敲除的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]进一步地，Elo5基因是一类产油硅藻的特有基因，一般以三角褐指藻作为该类产油硅藻研究的模式生物。
[0011]进一步地，上述阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量的方法，具体过程如下：针对Elo5基因序列的特征分析，设计一个或多个sgRNA和Cas9蛋白通过微粒轰击的方法将导入到产油微藻(如三角褐指藻)细胞内，sgRNA引导Cas9蛋白对Elo5基因DNA片段进行部分核苷酸片段的切割，所切割的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，从而阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量，并得到一种不产DHA并富集EPA的工程藻株。
[0012]上述方法得到的阻断DHA合成并提高EPA相对含量的工程藻株，其Δ5延长酶基因经过基因编辑，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0014]第一，本专利技术通过对三角褐指藻Elo5进行基因编辑，敲除该基因后阻断EPA往DHA延长的代谢路径，同时实现积累更高含量EPA的效果，对于加速从海洋藻类中提取高纯度EPA提供具有前景的解决方案。
[0015]第二，本专利技术所提供的不产DHA的三角褐指藻工程藻株和野生型三角褐指藻相比，EPA相对含量在培养对数期和平台期分别提高了12.3％和37.0％。
附图说明
[0016]图1是Elo5基因被编辑后和野生型的部分序列比较(a)和被编辑后PCR验证(b)；
[0017]图2是脂肪酸测定气相色谱图；
[0018]图3是每g干重藻粉中各脂肪酸的含量；
[0019]图4是Elo5敲除株脂肪酸相对含量的组成分析。
具体实施方式
[0020]为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术不仅仅局限于下面的实施例。
[0021]实施例
[0022](1)Elo5基因的获取
[0023]通过微生物基因组公共数据库(http://protists.ensembl.org/index.html)筛选到一个三角褐指藻Elo5基因，该基因全长编码框核苷酸序列长度为1110bp，翻译的蛋白由369个氨基酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
[0024](2)Elo5基因编辑ribonucleoprotein(RNP)的组装
[0025]使用藻类CRISPR设计网站(https://www.phytocrispex.bio.ens.psl.eu/CRISP
‑
Ex/)选取针对Elo5基因编辑的导向序列(sgRNA)，根据所选择的6个sgRNA分别设计正反引
物，共计12条(表1)，退火后获得含平末端的双链DNA作为sgRNA。将得到的靶向Elo5基因的sgRNA以及靶向腺嘌呤磷酸核糖转移酶(ptAPT)的sgRNA一起作为DNA片段混合物与商业化的人源Cas9蛋白以1:10的摩尔比例在PBS缓冲液中充分震荡，组装为RNP复合物。
[0026]表1.Elo5 sgRNA引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种阻断DHA合成并提高EPA相对含量的工程藻株，其特征在于所述工程藻株为含有Δ5延长酶基因的产油微藻，其中的Δ5延长酶基因经过基因编辑，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.一种阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量的方法，其特征在于通过对编码C20脂肪酸延长酶的Δ5延长酶基因进行基因编辑，从而阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量。3.根据权利要求1所述的一种阻断产油微藻中DHA合成并提高EPA相对含量的方法，其特征在于对Δ5延长酶基因进行基因敲除，敲除的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚阳敏，郑明明，朱骏凯，姜海波，万霞，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：