一种基于海藻基因工程技术的虾青素制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于海藻基因工程技术的虾青素制备方法，具体指使用基因枪法将克隆出的β

【技术实现步骤摘要】
一种基于海藻基因工程技术的虾青素制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及一种基于海藻基因工程技术的虾青素制备方法。

技术介绍

[0002]雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种单细胞淡水绿藻，在环境胁迫条件下可以迅速诱导合成虾青素，其积累量可高达细胞干重的5％，是其它虾青素合成生物体积累量的一到多个数量级。雨生红球藻是目前首选的天然虾青素合成藻。虾青素是具有强抗氧化活性的类胡萝卜素，其抗氧化活性比其它类胡萝卜素高约15倍，比α
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生育酚高600倍，被公认为是“超级维生素E”。这种超强的抗氧化能力赋予虾青素广泛的医用价值，如提高人体的免疫能力、抗肿瘤活性等。
[0003]莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是单细胞绿藻，具有培养简单、生长快速等优点。莱茵衣藻的叶绿体内具有虾青素合成的底物β
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胡萝卜素。提取、纯化藻内积累的虾青素方便、成本低，并且衣藻可以封闭式培养，避免转基因生物安全性问题。β
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胡萝卜素酮化酶和β
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胡萝卜素羟化酶是将β
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胡萝卜素转变成虾青素的两个关键酶。到目前为止，衣藻类胡萝卜素基因工程研究的报道甚少，更未见有可以便捷、安全、稳定地生产虾青素的制备方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于通过基因枪法将从雨生红球藻克隆出的β
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胡萝卜素酮化酶基因(bkt)，转入至莱茵衣藻的叶绿体中，使得bkt基因在衣藻细胞中得到表达。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0005]1.雨生红球藻与野生型衣藻均由深圳市华大海洋研究院实验室提供，雨生红球藻采用MCM培养基培养，野生型衣藻采用TAP培养基培养。
[0006]2.p64Dbkt衣藻叶绿体表达载体，含有衣藻叶绿体同源片段 clpP
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trnL
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petB及CRL基因并克隆有aptA
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aagA
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rbcL表达盒和aptA
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bkt
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rbcL表达盒，由本实验室构建。
[0007]3.根据NCBI上报道的雨生红球藻bkt的cDNA序列，设计bkt上下游引物(P1、P2)；根据aagA基因序列和衣藻叶绿体CRL基因序列设计PCR 引物(P3、P4)，鉴定转化子。引物由上海生工生物工程公司合成。
[0008]4.收集15mL处于对数生长后期的莱茵衣藻细胞，涂于TAP固体平板 (中央直径大约6cm)。于20℃，光照强度1400lx，光/暗周期12h/12h培养2d。在轰击压力1500Pa和轰击距离8cm条件下，进行基因枪转化，同时用不加质粒DNA的金粉轰击衣藻细胞作为对照。轰击后的衣藻平皿置于光照条件140lx的弱光下培养24h。然后用1.5mL无菌TAP培养基洗下，涂布于含120mg/L壮观霉素的固体选择培养基上进行筛选，完成莱茵衣藻叶绿体转化；其次，提取对壮观霉素具有抗性的莱茵衣藻基因组总DNA，具体提取方法参照说明书。为了进一步鉴定bkt基因通过同源重组定点整合到衣藻叶绿体基因组中，采用一对引物(P5)上游设计在
叶绿体片段CRL基因5
′
端，下游引物与bkt基因3
′
端互补(bkt2)，进行PCR扩增，完成 PCR扩增鉴定转化子的过程；之后，提取PCR鉴定含有aagA和bkt这两个表达盒的衣藻转化子基因组总DNA。将总DNA进行EcoRV和Sac I双酶切，37℃，4～5h。将酶切后的样品进行琼脂糖电泳，采用电转移法转膜，然后与地高辛标记的bkt基因探针进行杂交。bkt基因探针的标记，以及具体的杂交操作参照地高辛DNA标记和检测试剂盒说明书进行，完成基因组酶切Southern blot分析过程。最后，采用RNA提取试剂盒RNeasy Plant Mini Kit提取处于对数生长后期的衣藻转化子及野生型衣藻总RNA；用 RNase
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free DNase I消化去除基因组DNA的污染。通过分光光度计进行RNA 定量。取1μg RNA作模板，用反转录酶MMLV RNase H
‑
进行反转录合成 cDNA第一链，然后以cDNA第一链为模板，以引物bkt1/bkt2进行PCR扩增。将PCR产物电泳、转膜、Southern杂交，完成莱茵衣藻转化子RT
‑
PCR及 RT
‑
PCR Southernblot分析。
[0009]5.所述引物分别为：P1：5
’
CACGGATCCCAGAATGCTCGCATCG 3
’
(SEQID NO：1)、P2：5
’
CGGTCGACCCCGGACCAGGTCATGCCAA 3
’
(SEQ ID NO： 2)、P3：5
’
ATGGCAGAAGCGGTGCCGAA 3
’
(SEQ ID NO：3)、P4： 5
’
ATTTGCACTACCTT 3
’
(SEQ ID NO：4)、P5：5
’
AAAAGGTTTGAACAATG 3
’
(SEQ ID NO：5)。
[0010]6.本专利技术具有的优点：
[0011](1)高等植物普遍存在生命周期长，以及基因逃逸带来的安全性等问题。而本专利技术中选取的莱茵衣藻是单细胞绿藻，素有“光合酵母”之称，生长速率快、生殖周期短，是细胞和分子生物学研究领域的模式生物之一。
[0012](2)本实验采用了atpA启动子调控外源基因表达，调控序列启动的活性较强。
[0013](3)本专利技术采用叶绿体转化的策略。外源基因在叶绿体中以多拷贝的形式存在，基因表达通常比细胞核转化的表达量高出几十倍，甚至几百倍；且外源基因通过同源重组定点整合到叶绿体基因组中，避免随机整合所造成的不利影响。
[0014](4)本专利技术首次尝试了在衣藻中表达类胡萝卜合成途径相关酶，以期改善类胡萝卜素代谢途径，在衣藻细胞中积累虾青素，且取得了可靠效果。
具体实施方式
[0015]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，但是所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0016]实验材料及试剂盒
[0017]RNA提取试剂盒RNeasy Plant Mini Kit为Qiagen公司产品；反转录酶 MMLV RNase H
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为Promega公司产品；限制性内切酶、pyrobest Taq DNA聚合酶和RNase
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free DNase I为TaKaRa公司产品；壮观霉素购自上海生工生物公司本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于海藻基因工程技术的虾青素制备方法，其特征在于简单便捷，所述方法包括以下步骤：通过基因枪法将克隆出的β
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胡萝卜素酮化酶基因(bkt)建立在衣藻表达载体上，转入至莱茵衣藻细胞中，经过培养基筛选得到转化子；通过PCR和基因组酶切Southern杂交分析，证明bkt基因通过同源重组定点整合到转化子的叶绿体基因组中；通过RT
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【专利技术属性】
技术研发人员：卞超，陶明，逯峰，石琼，胡章立，
申请(专利权)人：深圳华大海洋科技有限公司深圳大学，
类型：发明
国别省市：