本发明专利技术公开了一种杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻及其构建方法与应用，属于分子克隆领域。本发明专利技术工程藻通过在杜氏盐藻导入苹果酸酶基因ME1和ME2中的至少一种得到；其中，所述的ME1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的ME2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术构建的苹果酸酶ME1过表达的工程藻ME1OE，油脂含量较野生藻提高了30.49％；苹果酸酶ME2过表达的工程藻ME2OE油脂含量提高了36.32％。本发明专利技术证明了结果表明过表达苹果酸酶可显著增加原始盐藻细胞中油脂含量，可在实际生产中进行应用。进行应用。进行应用。
【技术实现步骤摘要】
杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻及其构建方法与应用
[0001]本专利技术属于分子克隆领域，具体涉及杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻及其构建方法与应用。
技术介绍
[0002]由于对燃烧化石燃料引起的全球变暖的担忧和化石燃料资源的耗竭性，生物燃料作为一种极具吸引力的燃料在理论上具有巨大的优势和潜能。
[0003]微藻可以提供多种不同类型的可再生生物燃料，并且具有很强的适应性和生长速度，然而在自然状态下培养的微藻油脂产率普遍较低。因此利用基因工程技术构建高产油的工程微藻对于微藻的大规模应用和降低生物柴油的生产成本具有重要意义。
[0004]在脂质代谢中，苹果酸酶(malicenzyme,ME)起着重要作用。其能够与辅酶相结合，催化苹果酸发生氧化反应，进而脱羧，得到PA以及CO2这两类产物，同时还会产生NAD(P)H。鉴于底物特异性以及辅酶专一性方面的区别，可把ME划分成下述3个类型：
①
NAD
‑
ME(EC1.1.1.38)。此类型能够催化OAA发生脱羧反应；
②
NAD(P)+依赖型ME(EC1.1.1.39)。此类型可以利用NAD+，还可以利用NADP+，然更偏好于前者，无法催化OAA发生脱羧反应；
③
NADP
‑
ME(EC1.1.1.40)。此类型也可以催化OAA发生脱羧反应。目前，已从多种产油微生物中克隆了苹果酸酶基因，证明了该酶在油脂积累过程中的关键作用。在产油微生物油脂合成过程中，通过人工调控苹果酸酶来调控碳流，提高苹果酸酶活性，为脂肪酸合成提供充足的还原力NADPH，从而调控油脂积累的增加。
[0005]杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种可移动的单细胞无壁绿藻，可积累β
‑
胡萝卜素，细胞大小约为6
‑
14μm。它具有很高的耐盐性和耐光性并且具有较高的生长速率，目前已经商业化用于生产β
‑
胡萝卜素。但野生盐藻的油脂产率并不能够达到商业化生产的目的，因此，构建一种稳定高产的产油脂的杜氏盐藻是一项具有重大意义的工作。
技术实现思路
[0006]为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻。该工程藻以杜氏盐藻为材料，通过使苹果酸酶(ME)在重组藻细胞内过量表达，可实现杜氏盐藻油脂产量的增加。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供通过上述杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻的构建方法。
[0008]本专利技术的再一目的在于提供通过上述杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻在生产油脂中的应用。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]一种杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻，所述的工程藻通过在杜氏盐藻导入苹果酸酶基因ME1和ME2中的至少一种得到；其中，所述的ME1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的ME2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]进一步地，所述的杜氏盐藻为杜氏盐藻CCAP 19/18。
[0012]进一步地，所述的苹果酸酶基因的导入通过同源重组技术实现；具体操作为：将含有苹果酸酶基因的重组质粒导入杜氏盐藻。
[0013]所述的重组质粒为以pCR2.1为骨架载体，将杜氏巴氏藻内源性的启动子基因序列Dbzdspro、博来霉素和绿色荧光蛋白基因序列ble
‑
EGFP、杜氏巴氏藻内源性的终止子基因序列Dblycbter、杜氏巴氏藻内源性的启动子基因序列Dbgapdhpro、杜氏盐藻苹果酸酶基因序列ME1或ME2、以及杜氏巴氏藻内源性的终止子基因序列Dbpsyter按转录方向依次连接在一起得到。
[0014]当所述的果酸酶基因为ME1时，重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；当所述的果酸酶基因为ME2时，重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015]上述杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻的构建方法，包括如下步骤：
[0016](1)利用基因工程手段从杜氏巴氏盐藻中克隆到启动子基因序列Dbzdspro和Dbgpdhpro，终止子基因序列Dblycbter和Dbpsyter，合成苹果酸酶基因序列ME1和ME2，以及博来霉素
‑
绿色荧光蛋白基因序列ble
‑
EGFP；
[0017](2)将启动子基因序列Dbzdspro、博来霉素和绿色荧光蛋白基因序列ble
‑
EGFP、终止子基因序列Dblycbter、启动子基因序列Dbgapdhpro、苹果酸酶基因序列ME1或ME2、以及终止子基因序列Dbpsyter按转录方向依次连接到pCR2.1载体上，得到重组质粒；
[0018](3)将步骤(2)得到的重组质粒转化到大肠杆菌中扩大培养，提取质粒并转化到杜氏盐藻中，获得所述的基于杜氏盐藻代谢途径的高产油脂工程藻。
[0019]进一步地，步骤(2)中所述的连接优选通过In
‑
Fusion克隆技术实现。
[0020]进一步地，步骤(3)中所述的转化到杜氏盐藻中优选通过电击转化法实现。
[0021]进一步地，步骤(3)中所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。
[0022]上述杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻在生产油脂中的应用。
[0023]进一步地，所述的应用的步骤为：将所述的工程藻转移至培养基中培养12～16天，优选14天，用氯仿
‑
甲醇提取法提取油脂。
[0024]进一步地，所述的氯仿
‑
甲醇提取法的具体操作为：取稳定期藻液，离心，用1％NaCl溶液将细胞洗涤，加体积比1:1的氯仿/甲醇，涡旋震荡，加水至氯仿：甲醇：水＝体积比1:1:0.9；将混合液离心，混匀静置，收集下层氯仿层，并蒸去溶剂氯仿，即获得油脂。
[0025]进一步地，所述的培养基优选为含1～2mol/L氯化钠的杜氏盐藻培养液；更优选为含1.5mol/L氯化钠的杜氏盐藻培养液。
[0026]进一步地，所述的杜氏盐藻培养液的成分如下：NaNO
3 0.420g/L，NaH2PO4·
2H2O 0.156g/L，NaHCO
3 0.840g/L，KCl 0.074g/L，MgSO4·
7H2O 1.230g/L，CaCl2·
2H2O 0.044g/L，0.1％Fe
‑
EDTA液0.5mL/L；向培养液中加入A5微量元素溶液至终浓度为1mL/L，调pH至7.5；其中，Fe
‑
EDTA液成分如下：Na2EDTA 0.189g/L，FeCl3·
6H2O 0.244g/L；A5微量元素溶液成分如下：H3BO
3 2.86g/L，MnCl2·
4H2O 1.81g/L，ZnSO4·
7H2O 0.22g/L，CuSO4·
5H2O 0.08g/L，(NH本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻，其特征在于：所述的工程藻通过在杜氏盐藻导入苹果酸酶基因ME1和ME2中的至少一种得到；其中，所述的ME1编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的ME2编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻，其特征在于：所述的杜氏盐藻为杜氏盐藻(Dunaliellasalina)CCAP 19/18。3.根据权利要求1或2所述的杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻，其特征在于：所述的苹果酸酶基因的导入为：将含有苹果酸酶基因的重组质粒导入杜氏盐藻；所述的重组质粒为以pCR2.1为骨架载体，将杜氏巴氏藻内源性的启动子基因序列Dbzdspro、博来霉素和绿色荧光蛋白基因序列ble
‑
EGFP、杜氏巴氏藻内源性的终止子基因序列Dblycbter、杜氏巴氏藻内源性的启动子基因序列Dbgapdhpro、杜氏盐藻苹果酸酶基因序列ME1或ME2、以及杜氏巴氏藻内源性的终止子基因序列Dbpsyter按转录方向依次连接在一起得到。4.根据权利要求3所述的杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻，其特征在于：当所述的果酸酶基因为ME1时，所得重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；当所述的果酸酶基因为ME2时，所得重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.权利要求1～4任一项所述的杜氏盐藻苹果酸酶过表达工程藻的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)利用基因工程手段从杜氏巴氏盐藻中克隆到启动子基因序列Dbzdspro和Dbgpdhpro，终止子基因序列Dblycbter和Dbpsyter，合成苹果酸酶基因序列ME1和ME2，以及博来霉素
‑
绿色荧光蛋白基因序列ble
‑
EGFP；(2)将启动子基因序列Dbzdspro、博来霉素和绿色荧光蛋白基因序列ble
‑
EGFP、终止子基因序列Dblycbter、启动子基因序列Dbgapdhpro、苹果酸酶基因序列ME1或ME2、以及终止子基因序列Dbpsyter按转录方向依次连接到pCR2.1载体上，得到重组质粒；(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化到大肠杆菌中扩大培养，提取质粒并转化到杜氏盐藻中，获得所述的杜氏盐藻苹果酸酶过表...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜建国，何羽婧，陈浩宏，梁明华，谢珊蓉，戴聚良，吴婧璇，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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