一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻构建方法技术

本发明专利技术专利属于硅藻基因工程领域，主要发明专利技术一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻构建方法及其抑菌活性研究。本发明专利技术将三角褐指藻内源性强启动子HASP(highly abundant secreted protein)加上信号肽序列与经过密码子优化的拟穴青蟹中抗菌肽Scy基因融合构建外分泌表达载体，获得的Scy转基因藻株可以胞外分泌抗菌肽，而且分泌的抗菌肽可以有效抑制细菌的生长。长。长。

【技术实现步骤摘要】
一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻构建方法


[0001]本专利技术属于硅藻基因工程领域，特别涉及一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻构建方法及其抑菌活性研究。

技术介绍

[0002]抗菌肽是一类广泛存在于各种生物中的一类小分子多肽，一般由10～50个氨基酸组成。研究发现，抗菌肽可以有效地杀死病原微生物、病毒、致病原生动物等。抗菌肽的作用机制主要通过破坏细菌细胞膜的结构完整性，使细胞内外屏障丧失，从而杀死细菌。抗菌肽优点是分子量小、抗菌谱广泛、活性强、稳定性好，进入生物体内无有害残留，对细菌不会产生耐药性，逐渐成为新的可以代替传统抗生素替代品。然而，天然的抗菌肽在生物体内含量较少，提取困难，且制备的费用较高，因此利用基因工程技术是实现抗菌肽规模化生产的主要手段之一。
[0003]抗菌肽Scy首次从拟穴青蟹射精管中分离获得的一种阴离子抗菌肽。研究发现Scy具有广谱抗菌活性,且能抑制WSSV感染。利用大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统获得了Scy基因的表达产物，证明其对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，具有良好的抗菌特性。
[0004]目前，人们依靠以下三种方法获得抗菌肽：(1)直接从生物体内分离得到抗菌肽(2)通过化学合成方法获得抗菌肽(3)通过基因工程方法获得抗菌肽。从生物体内分离抗菌肽工艺复杂，步骤繁琐，而且提取抗菌肽的产量少，难以实现工业化生产。通过化学合成方法得到的抗菌肽价格昂贵，适用于科研研究，而通过基因工程方法获得抗菌肽，有利于工业化生产具有广泛应用前景。现在，利用基因工程表达外源蛋白系统主要有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。
[0005]大肠杆菌表达系统是最早建立并应用于表达外源蛋白的表达系统，是目前应用于最广泛外源表达系统。具有操作简单、成本低、目的蛋白表达量高等优点，抗菌肽的分子量小，将抗菌肽的基因构建在表达载体上并转化到大肠杆菌中，添加IPTG就可诱导大肠杆菌表达外源抗菌肽蛋白，大肠杆菌生长周期短且易操作，所以被广泛应用于表达外源蛋白。但是，大肠杆菌中有能引起免疫反应的内毒素，而内毒素会对抗菌肽的分离纯化造成困难；并且大肠杆菌是原核表达系统，缺乏对真核蛋白的折叠、修饰以及加工的生物过程，也容易形成包涵体，因此，原核表达系统获得的重组抗菌肽往往活性较低、具有细胞毒性。而在真核表达系统中应用最广泛是酵母，酵母是真核生物所以能够对蛋白进行加工和修饰，但酵母表达系统存在一个比较突出的问题，那就是对蛋白过度糖基化，会对抗菌肽的活性形成影响；同时，酵母表达量低，且后续分离纯化成本高，不利于工业应用。
[0006]三角褐指藻作为一种单细胞真核硅藻,它拥有进行细胞核并表达外源蛋白的真核表达系统。它的基因组在2008年就完成测序，遗传背景清晰，转化手段成熟。三角褐指藻可对蛋白进行加工和修饰，可正确表达外源蛋白，所以利用基因工程的方法将抗菌肽转入三角褐指藻体内是能够成功表达。三角褐指藻优点是生长速度快，能够进行光合作用，光周期
短，培养成本低且环保；还能直接用作鱼、虾等水生生物的饵料；三角褐指藻已作为细胞工厂成功表达异源活性物质，如单克隆抗体，生物塑料的前体等。综上所述，三角褐指藻可解决大肠杆菌和酵母表达的存在弊端问题。

技术实现思路

[0007]针对目前外源基因表达系统存在的问题，本专利技术提供了一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻的构建方法及抑菌活性的研究。本专利技术采用能够分泌到胞外的表达系统，将抗菌肽分泌到胞外，离心收集上清，藻液重复利用，继续培养，避免转基因生物带来的安全问题；采用增强型启动子HASP，提高抗菌肽的表达量；收集上清，将上清透析再经冷冻干燥获得干粉做抑菌验证。
[0008]本专利技术是这样完成的，一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻的构建方法，有以下四个步骤：
[0009](1)合成经密码子优化后拟穴青蟹中抗菌肽Scy基因CDNA序列，从文献中筛找适合三角褐指藻信号肽序列
[0010](2)构建HASP启动子
‑
信号肽
‑
抗菌肽
‑
FCPA终止子三角褐指藻的外分泌表达载体模式，得到表达的载体，命名为pH
‑
S
‑
Scy。
[0011](3)将表达的载体通过基因枪转化法转化到受体三角褐指藻，筛选阳性藻株
[0012](4)对阳性藻株的基因组DNA进行验证，还会从RNA水平和蛋白水平验证抗菌肽的表达，获得能稳定表达转基因藻株。
[0013]将HASP启动子加信号肽编码的序列和抗菌肽Scy基因连接并克隆到质粒中，构建一种外分泌表达抗菌肽载体，将构建表达的载体通过基因枪转化法转化到受体三角褐指藻，获得能稳定表达Scy转基因藻株。用到的质粒就是硅藻中常用的过表达T1质粒。
[0014]所述抗菌肽Scy是一种阴离子抗菌肽。
[0015]所述抗菌肽Scy基因序列是经过密码子优化后的，具有SEQ ID NO.1序列和氨基酸序列具有SEQ ID NO.2序列。
[0016]所述HASP启动子序列具有SEQ ID NO.3序列，在三角褐指藻中信号肽对应氨基酸序列具有SEQ ID NO.4序列和在三角褐指藻对应信号肽表达基因序列具有SEQ ID NO.5序列。
[0017]所述构建表达载体命名为pH
‑
S
‑
Scy。
[0018]所述一种能胞外分泌抗菌肽三角褐指藻的构建方法中所述抗菌肽Scy转基因三角褐指藻在抑制考克氏菌和Trelief5αChemically Competent Cell感受态细菌生长方面有明显抑菌效果。本专利技术可以将转基因三角褐指藻中的抗菌肽分泌到胞外，在启动子后面添加了一段54bp信号肽序列，其氨基酸序列为MNLRCILPFLLASFSAGA，见SEQ ID NO.4，在三角褐指藻中表达的基因序列为ATGAATCTTCGTTGTATCCTTCCGTTTCTCCTCGCAAGCTTCTCGGCTGGGGCT，见SEQ ID NO.5.
[0019]本专利技术采用三角褐指藻作为细胞工厂生产抗菌肽具有以下几个优点：(1)基因工程方法已经成熟，在三角褐指藻体内成功表达异源活性物质，如单克隆抗体，生物塑料的前体等(2)可以将表达的抗菌肽分泌到胞外，避免转基因生物带来的安全问题(3)三角褐指藻生长周期短，能进行光合作用，还能直接用作鱼和虾的饵料。
[0020]Scy基因序列表SEDIQ No.1中的碱基序列序列表
[0021]SEQ ID No.1的信息
[0022](a)序列特征
[0023]长度：255核苷酸
[0024]类型：核苷酸
[0025]链型：单链
[0026](b)分子类型：DNA
[0027]序列描述：SEQ ID NO.1
[0028]ATGAAGGAAGACTCCAACATTTTGGACAAGACCGCCAAGATGACCAAGCAGAACAAGGCCCTCCTCTTCACCGCCGGAGGCGCCGCC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能胞外分泌抗菌肽的三角褐指藻的构建方法，其特征在于：将HASP启动子加信号肽编码的序列和抗菌肽Scy基因连接并克隆到质粒中，构建一种外分泌表达抗菌肽载体，将构建表达的载体通过基因枪转化法转化到受体三角褐指藻，获得能稳定表达Scy转基因藻株。2.根据权利要求1所述能胞外分泌抗菌肽三角褐指藻的构建方法，其特征在于：所述抗菌肽Scy是一种阴离子抗菌肽。3.根据权利要求2所述能胞外分泌抗菌肽三角褐指藻的构建方法，其特征在于：所述抗菌肽Scy基因序列是经过密码子优化后的，具有SEQ ID NO.1序列和氨基酸序列具有SEQ ID NO.2序列。4.根据权利要求1所述能胞外分泌抗菌肽三角褐指...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广策，高山，杨文婷，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：