一种提高杆状病毒系统生产腺相关病毒的方法及应用技术方案

本文公开了提高杆状病毒系统生产腺相关病毒的方法及应用。所述重组杆状病毒载体包含AAV衣壳蛋白基因表达盒(Cap)、AAV Rep基因表达盒(Rep)和腺相关病毒反向末端重复序列(ITR)的AD序列(AD)，所述ITR的AD序列可位于Rep基因表达盒后面，或者Rep基因表达盒以及Cap基因表达盒之间，及Cap基因表达盒后面。与包含Cap和Rep但没有AD序列的对照相比，携带包含Cap、Rep和AD序列的重组杆状病毒的昆虫细胞中杆状病毒和AAV的产生水平更高。本发明专利技术的方法应用于制备重组腺相关病毒，通用性强，效率高。高。高。

【技术实现步骤摘要】
一种提高杆状病毒系统生产腺相关病毒的方法及应用


[0001]本专利技术涉及杆状病毒表达载体，尤其是带有腺相关病毒AD序列的杆状病毒表达载体。本专利技术还涉及该杆状病毒表达载体制备重组腺相关病毒的应用。

技术介绍

[0002]腺相关病毒载体(AAV)是体外体内基因转移可靠的工具。其靶向性好，安全性高，转导能力强，在许多基因治疗临床试验中得到广泛的使用。包括家族性脂蛋白脂肪酶缺乏症，血友病，眼科以及肌肉脊髓等遗传疾病，均有在研临床报道。
[0003]腺相关病毒难以大规模培养导致其药物价格昂贵是限制其临床运用的主要障碍之一。目前腺相关病毒生产系统主要包括HEK293细胞系统、昆虫细胞杆状病毒系统、疱疹病毒系统。HEK293系统包装可贴壁培养以及悬浮培养，同时也包括两质粒或者三质粒转染的方式。其生产周期短，但涉及质粒，细胞等方面较为复杂，导致在实际生产过程中很难进行大规模培养，价格昂贵。疱疹病毒系统生产腺相关病毒，过程可能存在致敏性疱疹病毒，其安全性存在一定的潜在风险。昆虫细胞杆状病毒系统，由于其具有细胞密度高，可规模化培养，且安全性较好等优点，被认为是潜在克服腺相关病毒难以大规模培养的技术壁垒突破口之一。优化提高杆状病毒系统介导的腺相关病毒生产效率，是科学家的重点工作。
[0004]腺相关病毒反向末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)包含145个核苷酸，分为A、B、C、D四个组成部分。其中A
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A
’
,B
‑
B
’
,C
‑
C
’
三个部分125核苷酸组成T型回文发夹结构，作为病毒DNA复制引物起始腺相关病毒复制。A序列含有RBE(rep binding element)结构，是REP蛋白识别绑定位点1。B、C序列作为发夹结构臂，一旦突变或缺失，AAV包装能力显著下降2。D序列独立于T型发夹结构，对于腺相关病毒包装基因长度，病毒DNA复制以及病毒的感染能力至关重要3‑4。AD序列还包含转录起始信号(A序列88to 95，D序列126to 133)可以作为启动子起始基因转录5。George Aslanidi等人通过杆状病毒同源重组序列(HR)与RBE元件，提出通过杆状病毒即刻早期反式调节因子1(IE
‑
1)诱导结合HR元件，增强Rep，Cap基因表达，同时积累的Rep蛋白结合RBE元件，进一步促进Rep蛋白的积累6。然而使用AD序列促进杆状病毒包装，以及AD序列对杆状病毒系统生产的腺相关病毒效率的影响并未有相关报道。

技术实现思路

[0005]在一方面，本文提供了分离的核酸分子，其包括：
[0006]1)腺相关病毒(AAV)复制基因(Rep)表达盒和/或AAV衣壳蛋白基因(Cap)表达盒；以及
[0007]2)来自AAV反向末端重复序列(ITR)的AD序列或其功能性变体。
[0008]在一些实施方案中，所述AD序列或其功能性变体位于所述Rep表达盒内或者距离所述Rep表达盒不超过5kb。
[0009]在一些实施方案中，所述AD序列或其功能性变体位于所述Cap表达盒内或者距离
所述Cap表达盒不超过5kb。
[0010]在一些实施方案中，所述核酸分子中：1)所述AD序列或其功能性变体位于所述Rep表达盒内，并且距离所述Cap表达盒不超过5kb；2)所述AD序列或其功能性变体位于所述Cap表达盒内，并且距离所述Rep表达盒不超过5kb；或者3)所述AD序列或其功能性变体位于所述Rep表达盒和所述Cap表达盒之外，并且距离所述Rep表达盒和所述Cap表达盒均不超过5kb。
[0011]在一些实施方案中，所述AD序列或其功能性变体位于所述Rep表达盒内且位于终止密码子之后，和/或所述AD序列或其功能性变体位于所述Cap表达盒内且位于终止密码子之后。
[0012]在一些实施方案中，所述Rep表达盒和所述Cap表达盒以不同方向转录，并且所述AD序列或其功能性变体位于所述Rep表达盒的启动子和所述Cap表达盒的启动子之间。
[0013]在一些实施方案中，所述Rep表达盒和/或所述Cap表达盒的启动子为昆虫细胞启动子
[0014]在一些实施方案中，所述Rep表达盒和所述Cap表达盒的启动子分别独立地选自P10和Polh启动子。
[0015]在一些实施方案中，所述AD序列包括SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列。
[0016]在一些实施方案中，所述AD序列的功能性变体包括与SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列有至少60％、70％、80％或90％序列一致性的核苷酸序列，并且，当将所述核酸分子引入适合的宿主细胞后，能够提高所述AAV复制基因(Rep)表达盒和/或所述AAV衣壳蛋白基因(Cap)表达盒的在所述宿主细胞中的表达量。
[0017]在一些实施方案中，所述Rep表达盒用于转录和表达Rep78/Rep68和Rep52/Rep40蛋白。
[0018]在一些实施方案中，所述Cap表达盒用于转录和表达VP1以及VP2/VP3蛋白。
[0019]在一些实施方案中，所述Rep表达盒和/或所述Cap表达盒包括含有启动子序列的内含子序列。
[0020]在一些实施方案中，所述内含子序列含有的所述启动子为polh启动子。
[0021]在一些实施方案中，所述内含子序列包括SEQ ID NO:57所示核苷酸序列或其功能性变体。
[0022]在一些实施方案中，所述内含子序列位于Rep表达盒中Rep编码核苷酸序列530和531之间，以驱动Rep52/Rep40亚基编码序列的转录。
[0023]在一些实施方案中，所述其中所述内含子序列位于Rep表达盒中Cap编码核苷酸序列25和26之间，以驱动VP2和VP3亚基编码序列的转录。
[0024]另一方面，本文提供了包括上述核酸分子的表达载体。
[0025]在一些实施方案中，所述表达载体为以pFastBacTMDual为骨架的表达载体。
[0026]在一些实施方案中，所述表达载体为杆状病毒表达载体。
[0027]在一些实施方案中，所述杆状病毒载体通过Bac
‑
to
‑
BacTM杆状病毒表达系统制备。
[0028]在一些实施方案中，所述表达载体还包括另外的表达盒。
[0029]在一些实施方案中，所述另外的表达盒从5'至3'包括：
[0030]1)AAV的ITR；
[0031]2)启动子；
[0032]3)与所述启动子可操作地连接的目的基因；
[0033]4)多聚腺苷酸化信号；以及
[0034]5)AAV的ITR。
[0035]在一些实施方案中，所述另外的表达盒中的启动子为哺乳动物细胞启动子。
[0036]在一些实施方案中，所述目的基因包括蛋白或RNA编码序列。
[0037]另一方面本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分离的核酸分子，包括：1)腺相关病毒(AAV)复制基因(Rep)表达盒和/或AAV衣壳蛋白基因(Cap)表达盒；以及2)来自AAV反向末端重复序列(ITR)的AD序列或其功能性变体。2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述AD序列或其功能性变体位于所述Rep表达盒内或者距离所述Rep表达盒不超过5kb。3.如权利要求1或2所述的核酸分子，其中所述AD序列或其功能性变体位于所述Cap表达盒内或者距离所述Cap表达盒不超过5kb。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的核酸分子，其中：1)所述AD序列或其功能性变体位于所述Rep表达盒内，并且距离所述Cap表达盒不超过5kb；2)所述AD序列或其功能性变体位于所述Cap表达盒内，并且距离所述Rep表达盒不超过5kb；或者3)所述AD序列或其功能性变体位于所述Rep表达盒和所述Cap表达盒之外，并且距离所述Rep表达盒和所述Cap表达盒均不超过5kb。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的核酸分子，其中所述AD序列或其功能性变体位于所述Rep表达盒内且位于终止密码子之后，和/或所述AD序列或其功能性变体位于所述Cap表达盒内且位于终止密码子之后。6.如权利要求1
‑
5任一项所述的核酸分子，其中所述Rep表达盒和所述Cap表达盒以不同方向转录，并且所述AD序列或其功能性变体位于所述Rep表达盒的启动子和所述Cap表达盒的启动子之间。7.如权利要求1
‑
6任一项所述的核酸分子，其中所述Rep表达盒和/或所述Cap表达盒的启动子为昆虫细胞启动子。8.如权利要求1
‑
7任一项所述的核酸分子，其中所述Rep表达盒和所述Cap表达盒的启动子分别独立地选自P10和Polh启动子。9.如权利要求1
‑
8任一项所述的核酸分子，其中所述AD序列包括SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列。10.如权利要求1
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9任一项所述的核酸分子，其中所述AD序列的功能性变体包括与SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列有至少60％、70％、80％或90％序列一致性的核苷酸序列，并且，当将所述核酸分子引入适合的宿主细胞后，能够提高所述AAV复制基因(Rep)表达盒和/或所述AAV衣壳蛋白基因(Cap)表达盒的在所述宿主细胞中的表达量。11.如权利要求1
‑
10任一项所述的核酸分子，其中所述Rep表达盒用于转录和表达Rep78/Rep68和Rep52/Rep40蛋白。12.如权利要求1
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11任一项所述的核酸分子，其中所述Cap表达盒用于转录和表达VP1以及VP2/VP3蛋白。13.如权利要求1
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12任一项所述的核酸分子，其中所述Rep表达盒和/或所述Cap表达盒包括含有启动子序列的内含子序列。14.如权利要求1
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13任一项所述的核酸分子，其中所述内含子序列含有的所述启动子为polh启动子。15.如权利要求1
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14任一项所述的核酸分子，其中所述内含子序列包括SEQ ID NO:57
所示核苷酸序列或其功能性变体。16.如权利要求1
‑
15任一项所述的核酸分子，其中所述内含子序列位于Rep表达盒中Rep编码核苷酸序列530和531之间，以驱动Rep52/Rep40亚基编码序列的转录。17.如权利要求1
‑
16任一项所述的核酸分子，其中所述其中所述内含子序列位于Rep表达盒中Cap编码核苷酸序列25和26之间，以驱动VP2和VP3亚基编码序列的转录。18.包括权利要求1
‑
17任一项所述的核酸分子的表达载体。19.如权利要求18所述的表达载体，其中所述表达载体为以pFastBac
TM Dual为骨架的表达载体。20.如权利要求18或19所述的表达载体，其中所述表达载体为杆状病毒表达载体。21.如权利要求18
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20任一项所述的表达载体，其中所述杆状病毒载体通过Bac
‑
to
‑
Bac
TM
杆状病毒表达系统制备。22.如权利要求18
‑
21任一项所述的表达载体，其中所述表达载体还包括另外的表达盒。23.如权利要求18
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【专利技术属性】
技术研发人员：李华鹏，陈君霖，钟育健，
申请(专利权)人：广州派真生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：