一种助溶α-1，6/α-1，4嵌合大糖的制备及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种酶法合成纯化α

【技术实现步骤摘要】
一种助溶
α
‑
1，6/
α
‑
1，4嵌合大糖的制备及应用


[0001]本专利技术属于制备
，涉及一种α
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1，6/α
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1，4嵌合大糖的制备、纯化方法，简易测定平均链长的方法以及应用。

技术介绍

[0002]以白藜芦醇为代表二苯乙烯具多种生理功能，但受水溶性差的限制，这些活性功能在人或动物体内发挥较差。以环糊精为代表的药物载体构成的单分子分散体系，能够提高疏水客体分子的生物利用度。然而，环糊精能够包埋的客体分子尺寸受环糊精刚性空腔尺寸的限制。
[0003]聚合度在11～100之间的α
‑
葡聚糖被定义为大糖。右旋糖酐糊精酶或4，6
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α
‑
糖基转移酶作用于麦芽糊精得到的异麦芽大糖，是一种由非还原端α
‑
1，6糖链和还原端α
‑
1，4糖链构成的线性非分支嵌合糖，在增溶、减少促炎物质的渗透和免疫反应等方面显示出应用前景。然而位于还原端且较短的α
‑
1，4糖链，丧失了其原本可以由连续α
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1，4键形成特殊键角而在中性和酸性水溶液呈两亲性螺旋空腔的优势。
[0004]因此构建一种的由非还原端α
‑
1，4糖链和还原端α
‑
1，6糖链构成的线性非分支嵌合糖，在保留α
‑
1，4糖链的两亲性螺旋空腔的同时，由连续的α
‑
1，6糖苷键提供良好的水溶性。以这种的嵌合糖作为载体来实现疏水课题分子在水中的单分子分散。
[0005]酶法合成葡聚糖具有能效低，可定向调控的优点。来自罗伊氏乳杆菌180的葡聚蔗糖酶突变体L940W能够以蔗糖为底物，合成仅有α
‑
1，6糖苷键连接的低聚糖。γ
‑
环糊精葡萄糖基转移酶能以环糊精为供体，在受体底物上以α
‑
1，4糖苷键转移葡萄糖，实现在受体底物上麦芽寡糖链的延长。
[0006]如何获得α
‑
1，6/α
‑
1，4嵌合大糖对多糖的开发与单分子分散载体的设计具有重要的意义。

技术实现思路

[0007]专利技术人构建了一种多酶级联反应制备α
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1，6/α
‑
1，4嵌合大糖的方法，并提供了除去反应后剩余环糊精及低聚异麦芽糖的分离纯化方法，提供了简易测定嵌合大糖平均链长的方法，还验证了嵌合大糖对疏水性客体分子增溶的应用。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种酶法制备α
‑
1，6/α
‑
1，4嵌合大糖的方法。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供一种分离纯化α
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1，6/α
‑
1，4嵌合大糖的方法。
[0010]本专利技术的第三个目的是提供一种通过酶法降解α
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1，6/α
‑
1，4嵌合大糖快速测定平均链长的方法。
[0011]本专利技术的第四个目的是提供一种能够助溶疏水性客体分子的单分子分散体系载体。
[0012]本专利技术提供了一种酶法合成α
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1，6/α
‑
1，4嵌合大糖的方法，由以下步骤组成：
[0013](1)反应体系以柠檬酸钠或乙酸钠溶液为缓冲液，以蔗糖为底物(0.1～5.0M)，添
加葡聚糖蔗糖酶进行反应，反应后沸水浴灭酶；
[0014](2)离心除去变性蛋白，上清液透析后冻干磨粉过筛，获得低聚异麦芽糖；
[0015](3)反应体系以磷酸盐或甘氨酸溶液为缓冲液，以低聚异麦芽糖为受体底物，以γ
‑
环糊精为供体底物(供受体比例为0.5～5：1)，添加环糊精葡萄糖基转移酶进行反应，
[0016]沸水浴灭酶，以制备α
‑
1，6/α
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1，4嵌合大糖。
[0017]在本专利技术一种实施方式中，所述蔗糖的浓度优选为2M。
[0018]在本专利技术一种实施方式中，所述葡聚糖蔗糖酶为来自罗伊氏乳杆菌180的突变体GTF80
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ΔN L940W，酶添加量为0.5～2U/mL，优选为1U/mL；反应温度为30～40℃，优选为37℃；反应时间为8～24h，优选为12h。
[0019]在本专利技术一种实施方式中，所述葡聚糖蔗糖酶缓冲液柠檬酸钠或乙酸钠浓度为20～100mM，pH为4.5～6.0，优选为pH 5.0 50mM醋酸钠溶液，含1mM氯化钙。
[0020]在本专利技术一种实施方式中，所述透析袋孔径为1000Da，透析时间为36～50h，优选为48h。
[0021]在本专利技术一种实施方式中，所述受体底物异麦芽低聚糖的浓度为5～20mg/mL，优选为10mg/mL。
[0022]在本专利技术一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶为来源于芽孢杆菌FJAT～44876的γ
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环糊精葡萄糖基转移酶，酶添加量为0.05～0.30U/mg异麦芽低聚糖，优选为0.15U/mg异麦芽低聚糖；反应温度为40～55℃，优选为50℃；反应时间为0.5～6h，优选为2h。
[0023]在本专利技术一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶缓冲液磷酸或甘氨酸浓度为20～100mM，pH为6.0～10.0，优选为pH 10.0 25mM甘氨酸
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氢氧化钠缓冲液。
[0024]在本专利技术一种实施方式中，所述供受体比例优选为3：1(w/w)。
[0025]本专利技术提供了一种纯化α
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1，6/α
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1，4嵌合大糖的方法，由以下步骤组成：
[0026](1)上述反应体系由酸溶液调节pH至5.0～7.0，冷却后离心除去变性蛋白；
[0027](2)上清液加入外切型右旋糖酐酶反应10
‑
20h，沸水浴灭酶，冷却后离心除去变性蛋白；
[0028](3)上清液升温至70
‑
85℃后加入2～6％(w/v)环十二酮，震荡0.5～2h，降温至60～70℃
[0029]后持续震荡8～12h，冷却至4～8℃后持续10～20h。
[0030](4)吸取上清透过0.45μm有机滤膜，与溶液中的不溶物分离。
[0031](5)滤液透析后冻干磨粉，获得α
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1，6/α
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1，4嵌合大糖纯品。
[0032]在本专利技术一种实施方式中，所述酸溶液为盐酸或甘氨酸溶液，优选调节pH终点为6.0.
[0033]在本专利技术一种实施方式中，所述外切型右旋糖酐酶为来自变形链球菌的glucan1,6
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alpha
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glucosidase DexB，加酶量为0.5～2U/mL，优选为1U/mL；反应温度为30～37℃，优选为35本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶法合成α
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1，6/α
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1，4嵌合大糖的方法，其特征在于，由以下步骤组成：(1)反应体系以柠檬酸钠或乙酸钠溶液为缓冲液，以蔗糖为底物，添加葡聚糖蔗糖酶进行反应，反应后沸水浴灭酶；(2)离心除去变性蛋白，上清液透析后冻干磨粉过筛，获得低聚异麦芽糖；(3)反应体系以磷酸盐或甘氨酸溶液为缓冲液，以低聚异麦芽糖为受体底物，以γ
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环糊精为供体底物，添加环糊精葡萄糖基转移酶进行反应，沸水浴灭酶，以制备α
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1，6/α
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1，4嵌合大糖；其中供受体比例为0.5～5：1。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述蔗糖的浓度为0.1～5.0M。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述葡聚糖蔗糖酶为来自罗伊氏乳杆菌180的突变体GTF80
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ΔN L940W，酶添加量为0.5～2U/mL；反应温度为30～40℃；反应时间为8～24h。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述环糊精葡萄糖基转移酶为来源于芽孢杆菌FJAT～44876的γ
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环糊精葡萄糖基转移酶，酶添加量为0.05～0.30U/mg异麦芽低聚糖；反应温度为40～55℃；反应时间为0.5～6h。5.一种纯化α
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1，6/α
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1，4嵌合大糖的方法，其特征在于，由以下步骤组成：(1)将权利要求1步骤(3)反应体系由酸溶液调节pH至5.0～7.0，冷却后离心除去变性蛋白；(2)上清液加入外切型右旋糖酐酶反应10
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20h，沸水浴灭酶，冷却后离心除去变性蛋白；(3)上清液升温至70
‑
85℃后加入2～6％(w/v)环十二酮，震荡0.5～2h，降温至60～70℃后持续震荡8～12h，冷却至4～8℃后持续10～20h。(4)吸取上清透过0.45μm有机滤膜，与溶液中的不溶物分离；(5...

【专利技术属性】
技术研发人员：柏玉香，武雅珍，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：