本发明专利技术公开了一种两个定点敲除水稻基因OsZFP8的sgRNA的oligo DNA组及其应用，基因编辑OsZFP8的两个sgRNA核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，通过构建Crispr Cas9基因编辑载体利用农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，筛选鉴定获取阳性转基因植株，实现对水稻OsZFP8基因的敲除。利用Crispr Cas9基因编辑系统获取的两种不同突变方式的突变体稻米均出现垩白粒率显著增高，稻米胚乳呈不透明状。通过转基因方法将野生型正常有功能的OsZFP8基因CDS序列导入突变体中，可使突变体稻米胚乳恢复到野生型透明表型。利用本发明专利技术制备的sgRNA可高效、快速、精确靶向编辑水稻OsZFP8基因，在基础研究(水稻胚乳发育与稻米品质分子机理)和生产实践(水稻品质改良)上具有一定的意义。有一定的意义。有一定的意义。
【技术实现步骤摘要】
两个定点敲除水稻基因OsZFP8的sgRNA的oligo DNA组及其应用
[0001]本专利技术涉及生物技术和植物基因工程
，具体涉及两个定点敲除水稻基因OsZFP8的sgRNA的oligo DNA组及其应用。
技术介绍
[0002]水稻作为我国重要的粮食作物，是全球一半以上人口的主食。稻米品质的优劣对其商业价值高低及是否满足人民日益提升的需求起至关重要作用。垩白，稻米胚乳中存在的白色不透明部位，其评价指标包括垩白度、垩白粒率、垩白面积等。这是由于胚乳中的淀粉体与蛋白质体之间存在间隙，排列疏松导致光线折射所形成的不透明现象，是限制稻米外观品质的重要因素，降低商品价值，同时还会影响稻米加工(降低整精米率)及蒸煮品质，是限制我国优质稻米达标率的主要原因之一。长期以来，稻米外观品质改良是稻米品质改良改良任务中的重中之重。因此，需要在做到稳产的同时，降低稻米垩白粒率、提高整精米率，实现高质育种目标。目前科研人员通过QTL定位及突变体基因的图位克隆法挖掘了一系列与垩白相关的基因，但依旧无法满足品质改良的巨大需求。挖掘与研究新的影响垩白性状基因并应用于水稻品种选育，具有重要的理论意义和生产应用潜力。
技术实现思路
[0003]本专利技术所要解决的问题是：提供一种两个定点敲除水稻基因OsZFP8的sgRNA的oligo DNA组及其应用，本专利技术从水稻中挖掘一个控制稻米垩白粒率基因(水稻锌指蛋白C2H2基因命名为OsZFP8)，该基因具有影响籽粒垩白粒率，控制水稻千粒重的功能，能够用于水稻改良，旨在利用此基因提高产量，改良稻米品质。本专利技术提供了一种基于CRISPR
‑
CAS9技术敲除水稻OsZFP8的sgRNA以及用于敲除水稻OsZFP8基因的载体。使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻OsZFP8的方法。
[0004]本专利技术为解决上述问题所提供的技术方案为：一种两个定点敲除水稻基因OsZFP8的sgRNA的oligo DNA组，包括OsZFP8基因的两个sgRNA的靶位点，其DNA序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示；根据靶序列设计的四条oligo DNA：一个oligo DNA组为OsZFP8(1)F和OsZFP8(1)R，另一个oligo DNA组为OsZFP8(2)F和OsZFP8(2)R，以上四条oligo DNA如序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0005]本专利技术还提供了一种如上述的两个定点敲除水稻OsZFP8基因的sgRNA的oligo DNA组在水稻OsZFP8基因编辑育种中的应用。
[0006]本专利技术还提供了一种两个定点敲除水稻OsZFP8基因的sgRNA的载体，该载体为CRISPR/Cas Vector
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BGK03，将两组oligo DNA：OsZFP8(1)F和OsZFP8(1)R，OsZFP8(2)F和OsZFP8(2)R混合，退火反应形成二聚体结构，与线性化BGK03载体片段连接，分别构建含有水稻OsZFP8基因靶序列的BGK03
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ZFP8
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cas9质粒，OsZFP8(1)F核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，OsZFP8(1)R核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，OsZFP8(2)F核苷酸序列如SEQ ID NO.5所
示，OsZFP8(2)R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0007]本专利技术还提供了一种两对鉴定OsZFP8基因的sgRNA靶区域编辑情况的引物对，sgRNA1靶区域引物对的DNA序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、sgRNA2靶区域引物对的DNA序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
[0008]本专利技术还提供了一种一种编码锌指转录因子(C2H2)的基因，所述基因是下列核苷酸序列之一：
[0009]1)该基因的基因组核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示，其CDS序列如序列表SEQ ID NO.12所示；
[0010]2)其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示；
[0011]3)其基因编辑的两个突变体基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，CDS序列如序列表SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；
[0012]4)其突变体基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.18及SEQ ID NO.19所示。
[0013]本专利技术还提供了一种如上述的编码锌指转录因子(C2H2)的基因在培育水稻胚乳垩白粒率变化的转基因植物中的应用。
[0014]本专利技术还提供了一种基于CRISPR
‑
CAS9技术敲除水稻OsZFP8的sgRNA以及用于敲除水稻OsZFP8基因的载体。使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻OsZFP8的方法，包括如下步骤：
[0015]a)选择OsZFP8基因序列第436
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455(编码区第3
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22)和第2217
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2236(编码区第789
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808)核酸序列两个靶位点作为CRISPR/Cas9系统的靶序列：
[0016](SEQ ID NO.1):GCTGAGTTCTTGCGCGCCGACGG
[0017](SEQ ID NO.2):AATGGTGAGTCCCCGTGCTGCGG
[0018]根据靶序列设计四条oligo DNA：
[0019](SEQ ID NO.3)ZFP8(1)F：TGATTGGCTGAGTTCTTGCGCGCCGA
[0020](SEQ ID NO.4)ZFP8(1)R：AAACTCGGCGCGCAAGAACTCAGCCA
[0021](SEQ ID NO.5)ZFP8(2)F：TGATTGAATGGTGAGTCCCCGTGCTG
[0022](SEQ ID NO.6)ZFP8(2)R：AAACCAGCACGGGGACTCACCATTCA
[0023]b)分别将oligo DNA组ZFP8(1)F和ZFP8(1)R、ZFP8(2)F和ZFP8(2)R混合，通过PCR仪95℃加热3min后均速降温至20℃(速度约为0.2℃/s)，退火反应形成二聚体结构；与已线性化的CRISPR/Cas Vector
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BGK03载体片段进行连接(20℃反应1h)，分别构建含有水稻OsZFP8基因靶序列的BGK03
‑
ZFP8
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cas9质粒。
[0024]c)将含有BGK03
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ZFP8
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cas9质粒的根癌农杆菌EHA105侵染水稻的愈伤组织，潮霉素筛选获取阳性转基因水稻植株。
[0025]d)利用ZFP8
...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种两个定点敲除水稻基因OsZFP8的sgRNA的oligo DNA组，其特征在于：包括OsZFP8基因的两个sgRNA的靶位点，其DNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；根据靶序列设计的四条oligo DNA：一个oligo DNA组为OsZFP8(1)F和OsZFP8(1)R，另一个oligo DNA组为OsZFP8(2)F和OsZFP8(2)R，以上四条oligo DNA如序列表SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。2.如权利要求1所述的两个定点敲除水稻OsZFP8基因的sgRNA的oligo DNA组在水稻OsZFP8基因编辑育种中的应用。3.两个定点敲除水稻OsZFP8基因的sgRNA的载体，其特征在于：该载体为CRISPR/Cas Vector
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BGK03，将两组oligo DNA：OsZFP8(1)F和OsZFP8(1)R，OsZFP8(2)F和OsZFP8(2)R混合，退火反应形成二聚体结构，与线性化BGK03载体片段连接，分别构建含有水稻OsZFP8基因靶序列的BGK03
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ZFP8
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cas9质粒，OsZFP8(1)F核苷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡怡聪，秦璐，钟智慧，贺浩华，胡培松，唐绍清，魏祥进，焦桂爱，边建民，徐杰，周大虎，陈小荣，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：
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