一种噬菌体抗性工程菌株的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种噬菌体抗性工程菌株的筛选方法，包括以下步骤：通过Tn5转座突变技术获得发酵菌株突变体文库，利用模式噬菌体筛选构建具有噬菌体抗性的发酵菌株突变体库；通过验证部分突变体的抗噬菌体、生长以及表达能力，获得改造成功的性状优良的抗性突变发酵菌株库。株库。

【技术实现步骤摘要】
一种噬菌体抗性工程菌株的筛选方法


[0001]本专利技术涉及一种噬菌体抗性工程菌株的筛选方法。属于大肠杆菌菌株


技术介绍

[0002]大肠杆菌是常用重组蛋白表达宿主菌，具有易于操纵、培养成本低廉、目的蛋白产量大等优势，被发酵企业或实验室视为生产重组蛋白的首选菌种。噬菌体污染是微生物发酵过程中不容忽视的问题。噬菌体污染会导致发酵菌株被裂解，发酵产物回收率降低，科研实验失败，企业停产，给科研机构和企业造成极大的经济损失。针对噬菌体污染，可以用净化生产环境这一方法进行防治，但是无论实验室或工厂的做法和卫生条件有多好，噬菌体感染也仍时有发生；使用不同的发酵菌株进行菌种轮换也是常见的防治方法之一，但该方法不可能适用于任何发酵，而且轮换菌种也有被侵染的可能；也可以使用噬菌体抑制剂进行防治，但噬菌体抑制剂的使用对宿主菌的生长、发酵生产性能、产物分离纯化和毒理学方面都有一定的限制。因此，抗噬菌体发酵菌株的选育可以从根本上避免噬菌体污染。
[0003]现有的抗噬菌体发酵菌株的选育有突变和基因工程两种方式。用基因工程改造菌株使其获得抗性的方法面临着效率低这一短板，而且改造后的单个菌种的生长、表达能力也无法保证。可以用突变的方法获得抗噬菌体菌株，包括自然突变、物理诱变、化学诱变等方法，自然突变较为常用，但耗时长、效率低，而物理、化学诱变的方法不能仅做到突变与噬菌体相关的基因，其安全性不确定。
[0004]转座子是细菌基因组中一段特异序列，可以以片段的形式在细菌基因组中自由地插入，造成插入突变。Tn5转座子具有随机性强、频率高、稳定新好等优点，目前对于Tn5转座突变应用上的研究都是用其随机突变野生株，从而获得抗性突变体库，分析抗性菌株的基因突变位点做受体分析，可以用这一方法获得具有目标抗性的高通量突变体库。重要的是，Tn5转座突变获得的突变株均为一些基因缺陷株，因其具有适应缺陷性，可能生长情况较野生型较差，不会导致生物污染问题。另一方面，自然界中不存在转座需要的Tnp转座酶，因此不会发生因引入转座子而导致自然界中生物随机突变的现象，其安全性可以保证。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种噬菌体抗性工程菌株的筛选方法，以解决以大肠杆菌为模板的工程菌株的噬菌体污染问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0007]一种噬菌体抗性工程菌株的筛选方法，具体步骤如下：
[0008](1)先对发酵菌株进行Tn5转座突变，获得Tn5转座子突变体文库；
[0009](2)然后将Tn5转座子突变体文库与噬菌体混合培养，高通量筛选，获得具有噬菌体抗性的菌株突变体库；
[0010](3)最后对菌株突变体库进行溶原菌株的筛除、突变株抗噬菌体能力验证、生长曲线及重组蛋白表达能力测定，获得噬菌体抗性工程菌株库。
[0011]优选的，步骤(1)中，所述发酵菌株为电穿孔导入温敏质粒pKD46
‑
lacI
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ptrc
‑
TnpA
‑
Cmr的大肠杆菌菌株BL21(DE3)，立即将样品转移到SOC培养基(购自青岛海博生物，液体培养基)中。
[0012]进一步优选的，电穿孔使用Eppendorf Eporator、bio
‑
rad MicroPulser或Invitrogen Neon等脉冲控制器，预设参数190～230Ω，20～25μF，1.2～1.6kV。
[0013]优选的，步骤(1)的具体方法为：将Tn5转座子加入到电穿孔合格的发酵菌株菌液中，接合转移后，将混合液点滴于涂布了1mM 2,6
‑
DAP(2,6
‑
二氨基吡啶)、50mM MgCl2、和40mM IPTG(异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷)的LB固体培养基，30℃培养9h，即得。
[0014]优选的，步骤(1)中接合转移的具体方法为：Tn5转座子由MFDpir菌株(山东大学微生物技术国家重点实验室)提供，MFDpir菌株的培养条件如下：含100mg/mL Amp(氨苄西林)+50mg/mL kan(卡那霉素)双抗生素及0.3mM 2,6
‑
DAP的LB液体培养基，37℃培养12h后离心(4℃，5000
×
g，10min)收集80～150μL菌体浓缩液。
[0015]优选的，步骤(1)中菌株BL21(DE3)的培养条件如下：LB液体培养基，30℃培养12h；按照两菌株细胞个数比1：1混合两菌体，得到混合液。
[0016]优选的，步骤(2)中，混合培养的具体方法为：将Tn5转座子突变体文库与感染率MOI为50的噬菌体溶液加入含50mg/mL卡那霉素的新鲜LB液体中，37℃培养12h，离心保留培养基重悬细菌即可。
[0017]优选的，步骤(2)中，高通量筛选的具体方法如下：
[0018](2
‑
1)抗性菌株的筛选
[0019]取混合培养所得菌液于96孔板中，加入含10mM MgSO4和50mg/mL卡那霉素的LB液体培养基，加入噬菌体后恒温孵育；在0、2、4、6、12和17小时读取OD
600 nm
的数值，取OD值高于不加菌液的阴性对照组的菌液，梯度稀释后涂布于带有Kan抗性的大肠杆菌显色培养固体板(购买于青岛海博生物，卡那霉素浓度为50mg/mL)以作筛选。
[0020](2
‑
2)抗性菌株的分离纯化
[0021]挑取单菌落，在带有Kan抗性的大肠杆菌显色培养固体板上划线纯化三轮及以上，获得突变菌株。
[0022]进一步优选的，步骤(2
‑
1)中，所述噬菌体的感染率MOI为50。
[0023]本专利技术的有益效果：
[0024]本专利技术通过高效转座子突变技术获得工程菌株突变体文库，公开了一种大肠杆菌噬菌体抗性突变体筛选方法。包括以下步骤：通过Tn5转座突变技术获得发酵菌株突变体文库，利用模式噬菌体筛选构建具有噬菌体抗性的发酵菌株突变体库；通过验证部分突变体的抗噬菌体、生长以及表达能力，获得改造成功的性状优良的抗性突变发酵菌株库。
[0025]根据发酵产业不同菌株的噬菌体污染具有多样性的特点，可使用本专利技术所描述的系统化方法，用针对性的噬菌体筛选特异性抗性菌株。与现有技术相比，本专利技术克服了大肠杆菌噬菌体抗性突变体筛选工作量大、效率低、突变体菌株生产性能不佳等技术难题，获得噬菌体抗性突变体概率大大增加；抗性分离率提高菌株生产性能良好。本专利技术将为解决发酵菌种的噬菌体污染问题提供有力的解决方案。
[0026]具体如下：
[0027](1)本专利技术克服了现有技术中以大肠杆菌为模板的工程菌株的噬菌体污染问题，
通过高效转座子突变技术获得工程菌株突变体文库，实现了大肠杆菌噬菌体抗性突变体的筛选。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种噬菌体抗性工程菌株的筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）先对发酵菌株进行Tn5转座突变，获得Tn5转座子突变体文库；（2）然后将Tn5转座子突变体文库与噬菌体混合培养，高通量筛选，获得具有噬菌体抗性的菌株突变体库；（3）最后对菌株突变体库进行溶原菌株的筛除、突变株抗噬菌体能力验证、生长曲线及重组蛋白表达能力测定，获得噬菌体抗性工程菌株库。2.根据权利要求1所述的一种噬菌体抗性工程菌株的筛选方法，其特征在于，步骤（1）中，所述发酵菌株为电穿孔导入温敏质粒pKD46
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lacI
‑
ptrc
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TnpA
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Cmr的大肠杆菌菌株 BL21（DE3），立即将样品转移到SOC培养基中。3.根据权利要求2所述的一种噬菌体抗性工程菌株的筛选方法，其特征在于，使用Eppendorf Eporator、bio
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rad MicroPulser或Invitrogen Neon脉冲控制器进行电穿孔。4.根据权利要求1所述的一种噬菌体抗性工程菌株的筛选方法，其特征在于，步骤（1）的具体方法为：将Tn5转座子加入到电穿孔合格的发酵菌株菌液中，接合转移后，将混合液点滴于LB固体培养基，30℃培养9h，即得。5.根据权利要求4所述的一种噬菌体抗性工程菌株的筛选方法，其特征在于，接合转移的具体方...

【专利技术属性】
技术研发人员：王静雪，王崟沣，玄冠华，林洪，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：