一种蔬菜芽孢杆菌及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种蔬菜芽孢杆菌及其筛选方法和应用，所述的蔬菜芽孢杆菌MZ4A4，保藏编号为CCTCC NO:M 20221376，蔬菜芽孢杆菌MZ4A4从烟末渣液中筛选得到，本发明专利技术筛选得到的蔬菜芽孢杆菌MZ4A4与对照组相比，能够利用TWE发酵液稳定发酵产气，有效改善再造烟叶的品质。有效改善再造烟叶的品质。有效改善再造烟叶的品质。

【技术实现步骤摘要】
一种蔬菜芽孢杆菌及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种蔬菜芽孢杆菌及其筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]烟草薄片又被称之为再造烟叶或再造烟草，烟草薄片的制造方法主要有三种：辊压法、稠浆法、造纸法。其中造纸法再造烟叶薄片是利用烟草废气料制作而成，由于造纸法有着良好的燃烧性能，较强的可塑性，较高的原料利用率等优点，已经得到了较大范围的推广和使用。
[0003]一些低档次烟叶和无法使用的碎片、烟末、碎烟梗废弃原料，经过固液分离法分离，将固留物通过类似造纸的方法再造成型形成片基，而分离液经过浓缩调制，以加料的形式涂布于片基制成再造烟叶薄片。TWE(tobacco waste extract)废烟草水提液，它是再造烟叶过程中的关键原料，是以水为溶剂来浸取烟草废弃物而制备成的。
[0004]TWE中微生物含量丰富，但是绝大多数的微生物无法适应这种环境，微生物调控TWE领域中的相关研究，国内外的报道较少，并且在高浓度TWE中具有调控能力的微生物报道更少。为了更高效的利用烟草薄片工艺中产生的废烟草水提液，寻求一株在高浓度TWE中正常生长并且能够改善再造烟叶品质的菌株有着较大的意义。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种蔬菜芽孢杆菌及其筛选方法和应用，筛选一种能够利用TWE发酵液稳定发酵产气，有效改善产品品质的菌株。
[0006]为达到上述目的，提出以下技术方案：
[0007]一种蔬菜芽孢杆菌(Bacillus oleronius)MZ4A4，保藏编号为CCTCC NO:M 20221376，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院；保藏日：2022年9月05日。
[0008]一种蔬菜芽孢杆菌MZ4A4的筛选方法，包括如下步骤：
[0009]1)取烟末渣液的发酵液，稀释，低温高速离心，弃下层沉淀物，再低温高速离心，弃上层清液，取下层菌液沉淀，加入无菌水重悬清洗菌体；
[0010]2)用蒸馏水配制体积分数为20％、40％、60％和80％的烟草废液提取物发酵稀释液，分别加入琼脂粉，加热灭菌后制成固体平板，并取经过步骤1)处理的菌液涂布到体积分数为20％的烟草废液提取物稀释固体平板上，恒温培养，用无菌水将菌体洗下进行梯度稀释后涂布到体积分数为40％的固体平板上，重复上述步骤依次涂布到体积分数为60％、80％的固体平板上，最后从体积分数80％的固体平板上洗下再涂布到体积分数80％的固体平板上，培养至长出单菌落后，挑单菌于LB液体培养基中进行培养，菌液离心去上清液，加无菌水重悬后接种到LB固体平板上进行平板划线纯化。
[0011]进一步地，步骤1)中低温温度范围为3
‑
5℃，高速离心转速为3000
‑
5000rpm。
[0012]一种蔬菜芽孢杆菌MZ4A4在调控烟草废液提取物品质中的应用。
[0013]本专利技术的有益效果在于：筛选得到的蔬菜芽孢杆菌MZ4A4能够适应高浓度TWE环境，并且能够高效地利用烟草薄片工艺中生产的废烟草水提液，能够改善再造烟叶品质。
附图说明
[0014]图1为蔬菜芽孢杆菌MZ4A4在LB固体平板上的菌落形态；
[0015]图2为蔬菜芽孢杆菌MZ4A4在40
×
相差显微镜下的情况；
[0016]图3为蔬菜芽孢杆菌MZ4A4与藤黄八叠球菌共同进行革兰氏染色的结果；
[0017]图4为蔬菜芽孢杆菌MZ4A4的透射电镜图片；
[0018]图5为蔬菜芽孢杆菌MZ4A4在TWE中发酵产气泡等级结果；
[0019]图6为在发酵过程中葡萄糖浓度的变化结果；
[0020]图7为发酵过程中总糖浓度变化结果；
[0021]图8为发酵初中末期液相结果检测图。
具体实施方式
[0022]下面结合说明书附图和实施例对本专利技术做进一步地说明，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。
[0023]实施例1
[0024]1)筛选蔬菜芽孢杆菌MZ4A4
[0025]取烟草薄片工艺中产生的一批烟末渣液的发酵液1ml，稀释5倍后，低温高速(4℃，3000rpm)离心3min，弃下层的沉淀物，再低温高速(4℃，5000rpm)离心3min，弃上清，取下层菌液沉淀，加入无菌水重悬清洗菌体2次；用蒸馏水配制体积分数依次为20％、40％、60％、80％TWE发酵稀释液，分别加入2％(100ml体积加入2g)的琼脂粉加热灭菌后制成固体平板，并取洗好的菌液100μl涂布到体积分数为20％的TWE稀释固体平板，三组平行，封口膜封口后倒置于37℃恒温培养箱中静置培养5
‑
10d，挑取平行组中菌落长势较好的一块平板，用无菌水将菌体洗下来梯度稀释10
‑3、10
‑4倍后分别取100μl涂布到体积分数为40％的TWE平板上，重复上述步骤依次涂布到体积分数为60％、80％的TWE平板上，最后从体积分数为80％的TWE平板上洗下来再涂布至另一体积分数为80％的TWE平板上，37℃培养箱培养7
‑
10d直至长出单菌落后，挑单菌于LB液体培养基中进行培养1d，取1ml菌液离心后弃上清，加无菌水重悬后用接种环在LB固体平板上进行平板划线纯化并将纯化后的菌株命名为MZ4A4。
[0026]2)菌株鉴定
[0027]将所得菌株参考伯杰氏系统细菌学手册(2012)进行生理生化实验鉴定及16S rDNA序列测序比对确定所得菌株的菌属。
[0028]待测菌株MZ4A4的形态学特征如下：如图1到图4所示，在LB培养基上菌落表面光滑，菌落颜色呈米黄色，边缘规则，菌落近似椭圆形，革兰氏染色为阳性，短杆状，无鞭毛。
[0029]生理生化实验及唯一碳源利用特性：
[0030]对菌株进行了可溶性淀粉水解酶活性实验，MR
‑
VP实验，脲酶水解实验，触酶实验，纤维素降解实验，酪蛋白水解实验，LB中耐热实验，LB中酸碱耐受性实验，LB中NaCl耐受实验，结果如表1所示，及唯一碳源利用实验，待测碳源为葡萄糖，木质素磺酸钠，D
‑
木糖，D
‑
果
糖，麦芽糖，蔗糖，D
‑
甘露糖，D
‑
乳糖，可溶性淀粉，结果如表2所示。在表1和表2中，“+”表示检测结果为阳性，
“‑”
表示检测结果为阴性。
[0031]表1菌株生理生化测试结果
[0032][0033][0034]表2菌株唯一碳源测试结果
[0035]唯一碳源特性MZ4A4葡萄糖+木质素磺酸钠
‑
蔗糖+D
‑
果糖
‑
麦芽糖+D
‑
木糖
‑
乳糖
‑
D
‑
甘露糖
‑
可溶性淀粉
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蔬菜芽孢杆菌(Bacillus oleronius)MZ4A4，保藏编号为CCTCC NO:M20221376。2.一种如权利要求1所述的蔬菜芽孢杆菌MZ4A4的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：1)取烟末渣液的发酵液，稀释，低温高速离心，弃下层沉淀物，再低温高速离心，弃上层清液，取下层菌液沉淀，加入无菌水重悬清洗菌体；2)用蒸馏水配制体积分数为20％、40％、60％和80％的烟草废液提取物发酵稀释液，分别加入琼脂粉，加热灭菌后制成固体平板，并取经过步骤1)处理的菌液涂布到体积分数为20％的烟草废液提取物稀释固体平板上，恒温培养，用无菌水将菌体洗下进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟卫鸿，吕梦琳，钱若男，黄海婵，何炎，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：