一种预测新的蛋白标志物的无创检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种预测新的蛋白标志物的无创检测方法及其应用，涉及蛋白标志物筛选技术领域，包括：获得体外受精胚胎的培养液；去除高丰度杂蛋白；提取剩余痕量胚胎分泌蛋白并酶解和脱盐；获得差异表达蛋白；对差异表达蛋白进行蛋白注释、蛋白功能富集以及蛋白

【技术实现步骤摘要】
一种预测新的蛋白标志物的无创检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及蛋白标志物筛选
，尤其涉及一种预测新的蛋白标志物的无创检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]体外受精
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胚胎移植(IVF
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ET)技术在帮助数百万不孕患者成功怀孕的同时，仍然面临着低植入率和高多胎妊娠率的问题。这两个问题主要源于我们无法通过定量多指标的检测方法来判断胚胎质量指导选择最具生殖潜力的胚胎进行移植。目前临床通常采用形态学评估来判断胚胎质量，即拥有丰富临床经验的医生借助光学显微镜观察胚胎的形态学变化，从细胞数目、排列紧密程度及碎片形成情况等综合评分来评估胚胎质量。除此之外，植入前基因检测(PGT)技术也是目前临床广泛使用的胚胎质量评估手段，PGT技术通过对胚胎进行植入前的遗传学分析来筛除携带潜在遗传学疾病风险的胚胎，是比形态学评估更有科学依据的评估手段。
[0003]形态学评估在一定程度上提高了植入率，但也存在较多问题。首先，虽然形态学评估有一定的评估标准，但实际上还是一种主观性判断，每个医生判断出来的结果可能都会存在差异。其次，形态学评估标准的理论依据还需要进一步进行验证，胚胎学家们临床实践中发现，即使是形态学评估为优质的胚胎，在植入环境良好的情况下，植入后也经常失败。这说明仅通过形态学评估无法挑选出真正具有生殖潜力的胚胎。PGT技术的实现弥补了形态学评估无法判断染色体异常的问题，但PGT技术需要从胚胎中取细胞进行检测，是一种侵入性的检测方式，可能对胚胎存在潜在的危害。除此之外，植入前遗传筛查已被证明不会增加活产率。
[0004]因此，如何构建一种无创、快速的技术评估胚胎质量，从而筛选出最具生殖潜力的胚胎是急需解决的重要技术难题之一。
[0005]细胞生长发育过程中会吸收营养物质并释放一些蛋白质到培养液中，这些分泌蛋白与胚胎发育质量密切相关。对不同培养时期的体外受精胚胎培养液进行检测，可以通过无创的方式筛选出与胚胎质量相关的蛋白标志物，实现实时跟踪和定性、定量评价胚胎发育质量的新策略。考虑到胚胎细胞受多种因素干扰，仅仅根据一个细胞因子来预测胚胎发育潜力并不可行，因此急需构建一种新的技术来快速筛选不同阶段胚胎培养液中与胚胎质量相关的新蛋白标志物。
[0006]近年来，蛋白质组学逐渐兴起使得筛选胚胎培养液中与胚胎质量相关的蛋白标志物成为可能。基于色谱
‑
质谱联用的蛋白质组学技术已经广泛应用于各种疾病的早期诊断和机理研究之中，因其检测时间短且灵敏度高，非常适用于检测植入前胚胎培养液的痕量样本。但由于胚胎发育过程中分泌到培养液中的蛋白数量少、浓度低、有高丰度杂蛋白干扰且质谱仪器的检测灵敏度受限，导致蛋白提取检测难度很大，所以目前为止在单个胚胎培养液检测方面还没有建立良好的非标记蛋白质组学检测的技术方法。
[0007]现有技术存在以下问题：
[0008]1、筛选人类胚胎培养液蛋白标志物取得较好效果的一般是靶向性的方法，靶向性的分析结果局限于已知的蛋白质，不能对培养液中的分泌组进行全面的检测和分析。
[0009]2、多数研究选用胚胎培养液混合样本检测的方式来弥补仪器检测灵敏度的不足，不能对单个人类胚胎微量的培养液中的分泌组进行分析。
[0010]3、没有针对单个胚胎培养液去除高丰度杂蛋白的策略，干扰低丰度标志物蛋白的定性定量分析。
[0011]4、现有的仪器检测灵敏度低，无法精确定性定量分析痕量蛋白标志物。
[0012]5、现有技术方法前处理蛋白提取步骤繁琐，仪器检测时间长。
[0013]因此，本领域的技术人员致力于开发一种基于质谱的非靶向性的、非标记痕量蛋白质组学技术筛选人体外受精胚胎质量预测新的蛋白标志物的无创检测新方法。

技术实现思路

[0014]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于非标记痕量蛋白质组学技术筛选体外受精胚胎质量预测新的蛋白标志物的无创检测新方法。
[0015]针对胚胎发育过程中分泌到培养液中的蛋白数量少、浓度低、有高丰度杂蛋白干扰且质谱仪器的检测灵敏度受限，导致蛋白提取检测难度很大等问题，提供一种基于非标记痕量蛋白质组学技术筛选体外受精胚胎质量预测新的蛋白标志物的无创检测新方法。采用本方法对不同培养时期的体外受精胚胎培养液进行检测，能够以无创的方法快速筛选出与胚胎质量相关的新蛋白标志物，实现实时跟踪和定性、定量评价胚胎发育质量的新策略。辅助形态学评估方法指导临床定量、多指标的筛选出最具生殖潜力的高质量胚胎，弥补形态学评估的主观性缺陷，为人体外受精胚胎质量评估提供科学依据。
[0016]为实现上述目的，本专利技术提供了一种预测新的蛋白标志物的无创检测方法，包括以下步骤：
[0017]步骤1、通过形态学评估获得培养不同天数、不同质量组的体外受精胚胎的第一培养液，胚胎划分为高质量胚胎组和低质量胚胎组；
[0018]步骤2、去除步骤1获得的第一培养液中的高丰度杂蛋白，得到第二培养液；
[0019]步骤3、从步骤2得到的第二培养液中提取剩余痕量胚胎分泌蛋白并进行酶解和脱盐处理，得到第三培养液；
[0020]步骤4、通过液相色谱
‑
质谱联用技术对步骤3获得的第三培养液检测，筛选高质量胚胎组和低质量胚胎组的差异表达蛋白(DEPs)；
[0021]步骤5、通过生物信息学分析对步骤4筛选出的DEPs进行蛋白注释、蛋白功能富集以及蛋白
‑
蛋白互作分析。
[0022]进一步地，步骤1中还包括以下步骤：
[0023]通过倒置光学显微镜对发育时间不同的体外受精胚胎细胞进行形态学评估，基于传统的胚胎评分标准，根据胚胎细胞的数目、大小、均一性和有无碎片对胚胎质量进行评分，将胚胎划分为高质量胚胎组和低质量胚胎组，分别收集不同天数的、不同质量组的胚胎细胞的第一培养液，立即冷冻保存。
[0024]进一步地，通过倒置光学显微镜对发育不同1
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6天的体外受精胚胎细胞进行形态学评估，基于传统的胚胎评分标准，根据胚胎细胞的数目、大小、均一性和有无碎片对胚胎
质量进行评分，将胚胎划分为高质量胚胎组和低质量胚胎组，分别收集不同天数的、不同质量组的胚胎细胞培养液约5
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12μL，立即放入
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80℃冰箱进行保存。
[0025]进一步地，步骤2中还包括以下步骤：
[0026]将冷冻保存的第一培养液取出，加入低吸附离心管中，并加入纯水稀释，得到稀释后的第一培养液；通过Pierce
TM
白蛋白消耗树脂吸附稀释后的第一培养液中的白蛋白，并用过滤柱洗脱剩余蛋白，得到第二培养液。
[0027]进一步地，步骤3还包括：
[0028]1)丙酮沉淀：向第二培养液中加入预冷的丙酮，放置在
‑
20℃冰箱过夜；2000g离心10min，收集第一沉淀并加入500μL丙酮，超声使蛋白均匀分布在溶液中，2000g本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种预测新的蛋白标志物的无创检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、通过形态学评估获得培养不同天数、不同质量组的体外受精胚胎的第一培养液，所述胚胎划分为高质量胚胎组和低质量胚胎组；步骤2、去除步骤1获得的第一培养液中的高丰度杂蛋白，得到第二培养液；步骤3、从步骤2得到的第二培养液中提取剩余痕量胚胎分泌蛋白并进行酶解和脱盐处理，得到第三培养液；步骤4、通过液相色谱
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质谱联用技术对步骤3获得的第三培养液检测，筛选所述高质量胚胎组和所述低质量胚胎组的差异表达蛋白(DEPs)；步骤5、通过生物信息学分析对步骤4筛选出的DEPs进行蛋白注释、蛋白功能富集以及蛋白
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蛋白互作分析。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中还包括以下步骤：通过倒置光学显微镜对发育时间不同的所述体外受精胚胎细胞进行形态学评估，基于传统的胚胎评分标准，根据所述胚胎的细胞数目、大小、均一性和有无碎片对所述胚胎的质量进行评分，分别收集所述不同天数的、所述不同质量组的所述胚胎细胞的所述第一培养液，立即冷冻保存。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2中还包括以下步骤：将冷冻保存的所述第一培养液取出，加入低吸附离心管中，并加入纯水稀释，得到稀释后的第一培养液；通过Pierce
TM
白蛋白消耗树脂吸附所述稀释后的第一培养液中的白蛋白，并用过滤柱洗脱剩余蛋白，得到所述第二培养液。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3还包括：1)丙酮沉淀：向所述第二培养液中加入预冷的丙酮，放置在
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20℃冰箱过夜；2000g离心10min，收集第一沉淀并加入500μL所述丙酮，超声使蛋白均匀分布在溶液中，2000g离心10min，收集第二沉淀；2)还原烷基化：向步骤1)收集的第二沉淀中加入盐酸胍和二硫代苏糖醇混合溶液，55℃还原1h；加入碘乙酰胺，室温避光孵育30min，得到还原烷基化样品；将所述还原烷基化样品转移至10kd超滤管膜上，14000g离心15min，用碳酸氢铵溶液清洗3
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4次，弃过滤液，将滤膜取出置于新的收集管中；3)蛋白酶解：向步骤2)得到的新的收集管中加入所述碳酸氢铵溶液重悬蛋白，再以1：50的质量比例加入0.2μg/μL的胰蛋白酶，涡旋振荡均匀，37℃酶解过夜；取出所述新的收集管，12000g离心20min；再加入125μL50mM的所述碳酸氢铵溶液清洗膜上蛋白，12000g离心10min；最后加入甲酸终止反应，得到样本滤液；4)脱盐：向脱盐柱中加入600μL质谱级甲醇，1000g离心1min；再加入200μL0.1％甲酸水，950g离心1min；以1：1的体积比加入步骤3)得到的样本滤液和0.1％甲酸水混合溶液，950g离心2min；用200μL0.1％甲酸水溶液淋洗两次，950g离心1min；更换低吸附外管，加入100μL60％乙腈
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0.1％甲酸水溶液，950g离...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁显廷，邓淑欣，沈广霞，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：