一种柯萨奇病毒A10型cDNA感染性克隆的构建方法技术

本发明专利技术提供一种CVA10中国临床分离株感染性克隆及其构建方法，大大简化了CVA10病毒的反向遗传学操作步骤，为今后CVA10病毒及其他肠道病毒反向遗传学技术的广泛应用提供了更简便的平台，并设计了7对引物对病毒全基因组进行测序分析，可应用于CVA10重要毒株的全基因组序列获取和病毒特性分析，从序列到克隆方法上都填补了国内肠道病毒研究的空白。法上都填补了国内肠道病毒研究的空白。

【技术实现步骤摘要】
一种柯萨奇病毒A10型cDNA感染性克隆的构建方法


[0001]本专利技术涉及RNA病毒拯救技术，特别涉及一种柯萨奇病毒A10型cDNA感染性克隆的构建方法，属于医学生物学


技术介绍

[0002]HFMD病原谱组成复杂多变，由柯萨奇病毒A10(CVA10)型引起的HFMD暴发逐渐增多，且经常与其他肠道病毒共传播，这对手足口病的防控提出了新的挑战。临床资料表明，CVA10感染一般导致轻度和自限性的疾病症状，包括发烧、口腔溃疡、手脚皮疹或水泡疹，国内外也有病毒性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹，神经呼吸综合征甚至死亡等重症病例的报道。CVA10在2010年法国和2013年中国武汉分别引起HFMD暴发流行。由于近年来CVA10感染的发病率和严重程度都有所增加，而肠道病毒的遗传物质在流行中易发生变异，导致流行毒株及其引发的HFMD症状的复杂性，因此，由CVA10感染导致的HFMD的疾病负担可能被严重低估，加强对CVA10等HFMD主要病原的相关研究对疾病的防控具有重要意义。
[0003]对RNA病毒来说，RNA分子在体外极易被降解，而且不能像DNA分子一样通过分子生物学技术手段进行修饰与改造，因此对RNA病毒的分子生物学研究进展相对缓慢，应用反向遗传学技术构建cDNA感染性克隆，可以实现在DNA水平上对病毒基因组进行改造，如定点突变、重组、缺失、插入和嵌合报告基因等，为研究病毒的基因结构和功能、病毒的致病机制及疫苗的研发奠定良好的基础。目前，反向遗传学技术已广泛应用于多种肠道病毒分子生物学研究和新型疫苗载体的构建等研究领域，包括脊髓灰质炎病毒，肠道病毒71型，柯萨奇病毒A6型，埃可病毒等，但是关于CVA10感染性克隆体系的建立和研究还很少，针对CVA10病毒的特效药物和疫苗仍未被发现，因此,关于CVA10病毒的致病机制仍需科研人员进行更深入的研究。
[0004]构建感染性克隆的实际操作中有不少困难，其中一个主要难点是基因组和载体片段的连接，首先在获得全长cDNA序列的操作过程中可能会引入非基因组序列，其次，如果插入的基因组片段比较大(7.4kb)，载体连接和转化效率都会相应下降，因此，构建CVA10病毒的cDNA感染性克隆需要维持基因组的稳定性和拯救病毒的感染性。

技术实现思路

[0005]针对现有CVA10病毒cDNA感染性克隆系统在构建和病毒拯救过程中存在的不足和问题，本专利技术的第一个目的是提供一株CVA10中国临床分离株序列，对该病毒的VP1序列进行遗传进化分析，完善中国CVA10病毒基因信息。本专利技术的第二个目的是提供本专利技术所述的CVA10中国临床分离株感染性克隆及其构建方法，为今后CVA10病毒反向遗传学技术的广泛应用提供思路。
[0006]本专利技术通过以下技术方案完成：
[0007]本专利技术提供一种柯萨奇病毒A10型cDNA感染性克隆的构建方法，所述方法包括如下步骤：
[0008](1)以柯萨奇病毒A10型的病毒RNA为模板，以Oligo(dT)为第一链引物，通过反转录得到第一链cDNA；再以所述第一链cDNA为模板，利用含酶切位点A和T7启动子序列的上游引物以及含酶切位点B和poly
‑
A尾的下游引物进行PCR扩增，所得产物纯化后，得到双链DNA；
[0009]其中，酶切位点A和酶切位点B可以相同，也可以不同，其作用在于方便对后续得到的质粒进行酶切，分离目的片段和载体片段。
[0010](2)根据TOPO
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TA克隆原理将步骤(1)所得双链DNA插入pCR
‑
XL
‑2‑
TOPO
TM
载体，得到CVA10基因组全长cDNA克隆质粒；
[0011](3)步骤(2)所得CVA10基因组全长cDNA克隆质粒用与所述酶切位点A、酶切位点B对应的限制性内切酶线性化，经琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、纯化后，所得CVA10基因组全长cDNA片段进行转录，所得转录产物纯化后转染宿主细胞(如Vero细胞)，进行传代培养，当观察到与柯萨奇病毒A10型毒株一致的肠道病毒致细胞病变现象，收集细胞培养液，提取出所述柯萨奇病毒A10型cDNA感染性克隆。
[0012]进一步，所述柯萨奇病毒A10型为CVA10
‑
4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：V202226，保藏日期：2022年4月29日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
[0013]进一步，步骤(1)中所述柯萨奇病毒A10型的病毒RNA采用病毒RNA提取试剂盒提取。
[0014]上述所有反转录都采用试剂盒Prime Script
TM
Ⅱꢀ
1st Strand cDNA Synthesis Kit完成。
[0015]在本专利技术的一个实施例中，所述酶切位点A为限制性内切酶SalⅠ的酶切位点，所述酶切位点B为限制性内切酶Not
ꢀⅠ
的酶切位点。
[0016]具体地，步骤(1)中所述含酶切位点A和T7启动子序列的上游引物的核苷酸序列为GTCGACTAATACGACTCACTATAGGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTG；
[0017]所述含酶切位点B和poly
‑
A尾的下游引物为GCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTATTCTGGTTATAACAAATTTAC。
[0018]进一步，步骤(3)中所述转录采用In vitro Transcription T7 Kit试剂盒。
[0019]进一步，步骤(3)中所述转染用Lipofectamin 3000试剂盒完成。
[0020]进一步具体地，在本专利技术的一个实施例中，所述方法包括：
[0021]S1、CVA10病毒的分离：将含柯萨奇病毒A10型的样本在DMEM培养液中充分搅动吹打，用0.2μm无菌滤膜过滤除菌；所得滤液接种到长满单层的Vero细胞上，使完全覆盖细胞，37℃，5.0％ CO2恒温培养箱中吸附2h后补加细胞维持液，继续培养；待有75％～100％细胞出现病变并脱落后，无菌收集病毒液，收获的病毒液反复冻融3次，(6000g)离心(30min)，以0.2μm无菌滤膜过滤，得到病毒液；
[0022]S2、CVA10全长cDNA克隆的构建：使用QIAamp Viral RNA Mini kit提取步骤S1中所述病毒液中的病毒RNA，以所述病毒RNA为模板，以OligodT为第一链引物，经PrimeScript
TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录出第一链cDNA；以上游引物A10
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F和下游引物A10
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A
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录出第一链cDNA；以上游引物A10
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SalI
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T7
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F和下游引物A10
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A
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R使用Prime STAR GXL高保真聚合酶对所述第一链cDNA进行PCR扩增，所得PCR产物经纯化，得到目的片段；上游引物A10
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F：GTCGACTAATACGACTCACTATAGGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTG下游引物A10
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R：GCGGCCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚苹苹，陈晨，朱函坪，孙一晟，徐芳，卢杭景，
申请(专利权)人：浙江省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：