一种血液样本病原体微生物宏基因组的去宿主方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种针对血液样本中病原微生物宏基因组的去宿主化核酸提取方法。包括如下步骤：1)全血样本中加入皂素溶液，室温双次孵育；2)加入NaCl溶液进行差异性震荡裂解，离心富集沉淀；3)重悬步骤2)沉淀，一次性加入HL

【技术实现步骤摘要】
一种血液样本病原体微生物宏基因组的去宿主方法


[0001]本申请属于体外诊断
，具体而言，涉及一种针对血液样本中病原体微生物宏基因组去宿主的方法。
技术背景
[0002]与传统培养鉴定方法相比，宏基因组测序对微生物病原的检测具有周期短、覆盖广、操作简易等诸多优势。面对临床很多不明原因的微生物感染鉴定，宏基因组测序覆盖全面的优势也越来越明显。病人感染往往不是单一微生物引起，宏基因组测序得到的微生物之间的相对丰度信息，能够为临床医生做出正确的诊疗方案，提供宝贵数据支持。
[0003]纳米孔测序是目前比较快捷方便的宏基因组研究方法，不过实践中，会面临临床样本含有大量宿主DNA的问题。
[0004]不同于痰液和肺泡灌洗液等临床感染样本，血液样本的样本处理和宏基因组检测更为复杂。全血中约有7
×
106/mL人源细胞，直接使用三代靶向测序得到的测序数据90％以上为人源序列。如何高效去除人源DNA背景，且最大限度保留样本溶液中微生物含量，提高病原菌的靶向富集效率和检出的灵敏度，是血液样本临床病原微生物宏基因组纳米孔测序的关键。现有技术中没有非常有效的针对血液感染样本的前处理方法，基于此，提出了本申请。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本申请对血液样本前处理方法进行了探索和优化，进而获得一种针对血液样本中病原微生物宏基因组的不完全去宿主方法，该方法在降低宿主核酸干扰满足上机建库条件下，实现微生物基因组的富集，同时将对病原体DNA的影响降至最低。有效提升血液标本宏基因组病原检出率，保证临床宏基因组病原微生物的检出灵敏度。
[0006]本申请具体采用的技术方案为：
[0007]本申请提供一种针对血液样本的病原体微生物宏基因组的去宿主化核酸提取方法，包括如下步骤：
[0008]1)全血样本中加入皂素溶液，室温双次孵育；
[0009]2)加入NaCl溶液差异性震荡裂解，随后离心富集沉淀；
[0010]3)重悬步骤2)沉淀，一次加入HL
‑
SAN反应Buffer和HL
‑
SAN DNase，混匀孵育；
[0011]4)加入PBS混匀，双次离心富集沉淀；
[0012]5)裂解液重悬沉淀，转入Lysis Matrix E管进行破壁仪破壁；
[0013]6)破壁完成后置于高速离心机，离心收上清；
[0014]7)对上清进行DNA核酸提取。
[0015]进一步的，步骤1)中所述皂素终浓度为0.1
‑
0.2％；
[0016]优选的，所述双次孵育为：全血样本中加入皂素溶液，室温条件下孵育5
‑
10min后加入无菌水再次孵育0.5
‑
1min。
[0017]进一步的，步骤2)中所述NaCl溶液终浓度为0.15
‑
0.2M；优选的，所述离心为：高速离心机，12000
‑
14000g离心3
‑
5min富集收集沉淀。
[0018]进一步的，步骤3)中的HL
‑
SAN反应Buffer成分包含2
‑
2.5g/100ml MgCl2和29
‑
30g/100ml NaCl；所述HL
‑
SAN DNase终浓度为24
‑
30U/ml。
[0019]进一步的，所述步骤3)具体为：PBS重悬步骤2)沉淀，一次性加入HL
‑
SAN反应Buffer和HL
‑
SAN DNase，充分混匀后置于金属浴上，35
‑
40℃800
‑
1000rpm下孵育10
‑
15min。
[0020]进一步的，所述步骤4)具体为：向步骤3)反应完成产物中，加入0.8
‑
1ml PBS颠倒混匀，12000
‑
14000g离心3
‑
5min，富集沉淀；沉淀中再次加入0.8
‑
1ml PBS重悬步骤4)沉淀，12000
‑
14000g离心3
‑
5min，富集沉淀。
[0021]进一步的，步骤5)中，所述破壁仪为净信破壁仪；所述裂解液为Zymo Lysis solution；
[0022]优选的，所述步骤5)具体为：Zymo Lysis solution裂解液重悬步骤4)获得的沉淀，并转入Lysis Matrix E管进行净信破壁仪破壁；所述破壁条件为15
‑
20m/s程序下珠击30
‑
120s。
[0023]进一步的，所述步骤6)具体为：将步骤(5)破壁完成管子置于高速离心机，15000
‑
17000g离心3
‑
5min，收集上清液。
[0024]进一步的，步骤7)具体为：
[0025]a、在步骤6)的上清中加入proteinase K，涡旋混匀，55
‑
60℃800
‑
1000rpm条件下孵育10
‑
15min；
[0026]b、瞬时离心后，加入Buffer BCL，混匀后70℃孵育3
‑
5min；
[0027]c、瞬时离心后加入无水乙醇，并转入吸附柱中，10000
‑
12000rpm离心1
‑
2min弃滤液；
[0028]d、向吸附柱中加入Buffer WA，10000
‑
12000rpm离心1
‑
2min弃滤液；
[0029]e、分两次，各加入Buffer WB，10000
‑
12000rpm离心1
‑
2min弃滤液；
[0030]f、用无核酸酶水悬空滴在柱膜上，室温静置1
‑
2min后10000
‑
12000rpm离心1
‑
2min，获得核酸。
[0031]与现有技术相比，本申请的有益技术效果至少包括：
[0032]本申请通过探索优化确立一种适用于临床血液样本的去宿主方法，该方法一方面通过不完全去宿主降低宿主核酸干扰，满足后续上机建库的条件下，实现微生物基因组的富集，另一方面还将对病原体DNA的影响降至最低，有效提升了血液样本病原检出率以及检出灵敏度。
[0033]本申请方法体系优势体现在多个方面，包括：在差异裂解去宿主环节，采用了皂素和NaCl的差异性裂解宿主细胞；在去除宿主DNA环节，使用了酶去消化暴露的DNA；在微生物菌体破壁环节，采用物理(玻璃珠机械破壁法)和化学(裂解液)联合的破壁法，实施细菌、真菌等细胞壁的破壁。
[0034]另外，在此流程框架下，本申请对体系中的关键组分的使用条件进行了全新优化，尤其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种针对血液样本的病原体微生物宏基因组的去宿主化核酸提取方法，其特征在于，包括如下步骤：1)全血样本中加入皂素溶液，室温双次孵育；2)加入NaCl溶液进行差异性震荡裂解，离心富集沉淀；3)重悬步骤2)沉淀，一次性加入HL
‑
SAN反应Buffer和HL
‑
SAN DNase，混匀孵育；4)加入PBS混匀，双次离心富集沉淀；5)裂解液重悬沉淀，转入Lysis Matrix E管进行破壁仪破壁；6)破壁完成后置于高速离心机，离心收上清；7)对上清进行DNA核酸提取。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述皂素终浓度为0.1
‑
0.2％。3.根据权利要求1
‑
2任一所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述双次孵育为：全血样本中加入皂素溶液，室温条件下孵育5
‑
10min后加入无菌水再次孵育0.5
‑
1min。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述NaCl溶液终浓度为0.15
‑
0.2M；优选的，所述离心为：高速离心机，12000
‑
14000g离心3
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5min富集收集沉淀。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的方法，其特征在于，步骤3)中的HL
‑
SAN反应Buffer成分包含2
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2.5g/100ml MgCl2和29
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30g/100ml NaCl；所述HL
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SAN DNase终浓度为24
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30U/ml。6.根据权利要求1
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5任一所述的方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：PBS重悬步骤2)沉淀，一次性加入HL
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SAN反应Buffer和HL
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SAN DNase，充分混匀后置于金属浴上，35
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40℃800
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1000rpm下孵育10
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15min。7.根据权利要求1
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6任一所述的方法，其特征在于，所述步骤4)具体为...

【专利技术属性】
技术研发人员：李杜衡，郑建坡，苗卉，王磊，李立峰，田文佳，涂浩波，蒋智，贾雪峰，
申请(专利权)人：天津金匙医学科技有限公司金匙智造天津医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：