一种单粒杂草种子DNA快速提取方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种单粒杂草种子DNA快速提取方法。本发明专利技术优化杂草种子DNA提取方法，并提供了检疫性杂草和特有的新外来记录种类ITS序列参考样品。利用本发明专利技术提供的一体化试剂盒可提高对杂草单粒种子分子检测鉴定效率，特有的种类参考样品为鉴定检疫性杂草和新外来记录杂草提供了准确的参照物。确的参照物。

【技术实现步骤摘要】
一种单粒杂草种子DNA快速提取方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种单粒杂草种子DNA快速提取方法。

技术介绍

[0002]检疫性杂草具有较强的竞争生长能力、适生性或毒性，为害农、林、生态，并给人或牲畜造成直接或间接危害的有害杂草。新截获杂草是指通过国际贸易，借助植物和植物产品以及交通运输工具等方式，跨境传入本国，并在本国口岸一线被截获检测的外来新记录种。
[0003]这类新截获杂草在我国无分布，是别国或地区的对我国有一定潜在危害的种类。此外，从植物和植物产品中检测到的杂草籽实通常小型或不完整，且数量极少，采用分子生物学鉴定时，如无规范的前处理阶段，很难提取目的基因片段，并造成样品损失，无法再取样鉴定。
[0004]因此，提供标准的检疫性杂草和新截获记录种的参考样品，优化针对单粒和微量杂草籽实的DNA提取和目的基因获取方法，对实际植检植保工作具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种杂草种子DNA快速提取方法，本专利技术的另一目的是提供鉴定检疫性杂草和新记录杂草的参考样品和试剂盒。
[0006]现有技术在对新截获杂草进行DNA提取时，由于杂草品种不确定，不能准确得知次生代谢产物的种类及含量，需要大量探究，浪费较多的样品，才能成功提取得到杂草的DNA；然而，新截获杂草籽实通常小型或不完整，且数量极少，新截获杂草籽实DNA提取的难度很高。
[0007]本专利技术提供的杂草DNA提取方法，普适性强，在无法确定待测杂草的种类时，采用本专利技术提供的方法可实现杂草种子DNA快速提取。本专利技术提供的DNA提取方法，即使针对不同品种的杂草种子，也可通过一次提取，获得多种杂草的基因组DNA。
[0008]本专利技术通过对6种检疫性杂草欧洲山萝卜、美丽猪屎豆、齿裂大戟、长芒苋、糙果苋、顶羽菊，和4种新记录外来杂草具翼补血草、间序青葙、滨藜叶莲子草的瘦果和种子进行微量DNA提取和ITS序列扩增研究，优化DNA前处理步骤，发现通过本方法可在样品量极少的情况下，成功实现一次性提取DNA和序列扩增工作。
[0009]第一方面，本专利技术提供一种提取杂草DNA的方法，包括：选择0.5
‑
2mg杂草种子破碎组织，在85
‑
95℃水浴锅中裂解6
‑
10分钟，静置后，10000
‑
12000rpm离心2
‑
4分钟，上清液中含有杂草基因组DNA。
[0010]在本专利技术提供的方法中，所述杂草种子的破碎组织为杂草种子胚乳破碎组织。在本专利技术提供的方法中，在水浴裂解后，至少静置5分钟，进行离心。本申请中，静置的作用是，使得杂草种子中的DNA溶于裂解液中，同时由于是在室温下进行的静置，其他次级代谢产物的溶出量少。
[0011]在本专利技术提供的方法中，所述杂草种子包括欧洲山萝卜、美丽猪屎豆、齿裂大戟、长芒苋、糙果苋、顶羽菊、具翼补血草、间序青葙、滨藜叶莲子草中的一种或多种。
[0012]第二方面，本专利技术提供一种杂草DNA阳性参考品，采用上述杂草DNA提取方法提取得到的基因组DNA作为杂草DNA阳性参考品。
[0013]本专利技术提供的杂草DNA阳性参考品中，所述杂草为检疫性杂草和/或新记录外来杂草；所述检疫性杂草包括欧洲山萝卜、美丽猪屎豆、齿裂大戟、长芒苋、糙果苋、顶羽菊；所述新记录外来杂草包括具翼补血草、间序青葙、滨藜叶莲子草。
[0014]第三方面，本专利技术提供一种检疫试剂盒，含有上述杂草DNA阳性参考品。
[0015]在本专利技术提供的检疫试剂盒中，所述检疫试剂盒中还包括DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs、DNA裂解液、DNA储存液、通用引物、专用样品研磨杵、硫酸纸、离心管，以及操作说明书。
[0016]根据本领域技术人员的理解，本专利技术还请求保护，上述杂草DNA提取方法或上述杂草DNA阳性参考品或上述的检疫试剂盒在鉴定未知杂草种子、或植物检验检疫中的应用。
[0017]在本专利技术所提供的应用中，采用上述杂草DNA提取方法，提取得到植物基因组DNA，采用通用引物进行PCR扩增反应，获得ITS序列进行序列比对，确定植物种类；
[0018]或者，采用上述的检疫试剂盒，与杂草DNA阳性参考品进行对照，确定植物种类。
[0019]本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过对6种检疫性杂草欧洲山萝卜、美丽猪屎豆、齿裂大戟、长芒苋、糙果苋、顶羽菊和4种新记录外来杂草具翼补血草、间序青葙、滨藜叶莲子草的瘦果或种子进行单粒或部分组织DNA提取和ITS序列扩增试验，提高了对微量杂草籽实DNA提取和目的序列扩增效率，节省了样品，提高鉴定效率。
[0020]利用本专利技术提供的杂草DNA提取和扩增方法，可实现对6种检疫性杂草欧洲山萝卜、美丽猪屎豆、齿裂大戟、长芒苋、糙果苋、顶羽菊和3种新记录外来杂草具翼补血草、间序青葙、滨藜叶莲子草的瘦果或种子的快速、准确检测鉴定，与现有技术中对于取样量需求较大的多粒种子提取方法相比，本专利技术提供的前处理方法更加有效，为快速鉴定检疫性杂草和新截获杂草提供了可靠的检测方法。
附图说明
[0021]图1为本专利技术的送检样品示意图。
[0022]图2为本专利技术制备得到的一种检疫试剂盒的示意图。
具体实施方式
[0023]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0024]本专利技术实施例1和实施例2中所用裂解液为2
×
T5 Direct PCR Kit(Plant)中的Lysis Buffer A，生产厂家为擎科生物。
[0025]实施例1杂草种子DNA快速提取方法
[0026]本实施例提供一种杂草种子DNA快速提取方法，本实施例中，送检样品示意图见图1，步骤如下：
[0027](1)将送检样品单粒瘦果或种子或不完整的瘦果或种子置于一次性培养皿中，用镊子在显微镜观察下清除表面杂质；
[0028](2)将单粒瘦果或种子，或不完整的瘦果或种子置于75
×
75毫米折叠好的硫酸纸中，用硫酸纸将瘦果或种子包好，用研磨杵隔着硫酸纸敲碎或碾碎；
[0029](3)取0.5～2毫克破碎组织置于1.5毫升或2毫升离心管中，加入0.5毫升裂解液，形成悬浊液；并用一次性移液器枪头将悬浊液搅拌，使破碎组织尽可能融于悬浊液中；
[0030](4)将悬浊液置于95℃水浴锅中裂解10分钟；
[0031](5)水浴后的悬浊液室温静置至少5分钟，离心(
×
12000rpm)2分钟，上清液含有的微量基因组DNA留待做模板；
[0032](6)以步骤(5)的基因组DNA为模版，用通用引物ITS1和ITS5进行PCR扩增反应；
[0033](7)PCR扩增反应产物送公司测序，获得ITS序列。
[0034]上述方法中，步骤(6)的PCR扩增反应体系以50μl计为：模板DNA 1μl，10pmol/μl正、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取杂草DNA的方法，其特征在于，包括：选择20
‑
100mg杂草种子破碎组织，在95℃水浴锅中裂解6
‑
10分钟，静置后，10000
‑
12000rpm离心2
‑
4分钟，上清液中含有杂草基因组DNA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述杂草种子的破碎组织为杂草种子胚乳破碎组织。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，水浴裂解后，静置至少5分钟，进行离心。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其特征在于，所述杂草种子包括欧洲山萝卜、美丽猪屎豆、齿裂大戟、长芒苋、糙果苋、顶羽菊、具翼补血草、间序青葙、滨藜叶莲子草中的一种或多种。5.杂草DNA阳性参考品，其特征在于，采用权利要求1
‑
3任一项所述方法提取得到的基因组DNA作为杂草DNA阳性参考品。6.根据权利要求5所述的杂草DNA阳性...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晗，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：