一种制备单链RNA的方法技术

本发明专利技术属于核酸生物技术领域，为解决现有单链RNA制备方法难以实现工业化生产的问题，提供了一种制备单链RNA的方法。针对目的单链RNA，先设计一个含有错配的、不对称性强的错配序列区域的无启动子环状双链DNA模板，其中一条链为模板链，转录出的RNA包含目的单链RNA；设计并制备辅助链Aid

【技术实现步骤摘要】
一种制备单链RNA的方法


[0001]本专利技术属于核酸
，具体涉及一种制备单链RNA的方法。

技术介绍

[0002]随着人们对RNA研究的不断深入，RNA的一些功能不断被揭示，在医药、食品、纳米材料等领域都显示出极好的发展前景，亟需充足的RNA来满足科研需求和市场需求。但是目前RNA的大量合成还未实现，导致RNA的价格十分昂贵，在很大程度上限制了RNA的研究和应用。
[0003]RNA制备方法可分为体外合成和体内合成(重组过表达)两大类，体外合成又可分为化学法合成和酶法合成两大类(Analytical and bioanalytical chemistry,2018,410,3239
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3252.)。目前用于体内制备RNA的宿主主要为大肠杆菌(E.coli)，以其作为宿主时生产周期短、产率高。也有利用亲硫菌(R.sulfidophilum)作为宿主的，产物被蛋白污染的程度较低，易纯化。但上述生物制备方法存在诸多问题，如产物易被胞内的RNA酶降解，缺少用于产物亲和纯化的有效tags，并且质粒载体的构建、转染、细胞培养、裂解、产物提取纯化等诸多步骤使得该方法在实际应用时较为繁琐(Analytical and bioanalytical chemistry,2018,410,3239
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3252.)。化学合成法(固相合成)目前应用良好，特别适用于小分子RNA(如小于25nt)药物，但存在产量低、合成步骤繁琐(有机化学,1994,14,17；Nature structural biology,1998,5,203
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212；Israel Journal of Chemistry,2013,53,326
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349.)、纯度差(Analytical biochemistry,2001,298,196
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206.)、无法合成长链RNA(CHIMIA International Journal for Chemistry,2005,59,812
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816.)、产品安全性差(使用多种有机试剂)(化学试剂,2000,22,5.)等问题。为了提高化学合成的产率，有研究人员在液相合成方面做了初步探索，但产率仍不尽如人意(陆威,核酸的化学合成研究以及4
′‑
C
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羟甲基修饰siRNA的合成及干扰活性测试,华中师范大学硕士学位论文,2014.)。酶法(转录法)是在RNA聚合酶体外转录的基础上发展起来的，相较化学合成而言，这种方法因在液相环境中进行而易于实现大规模生产。酶法可满足较长RNA的合成，并且整个过程中没有涉及到有害有机试剂，因此产品的安全性更高，对环境也更加友好(Israel Journal of Chemistry,2013,53,326
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349；CHIMIA International Journal for Chemistry,2005,59,812
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816.)。近些年的研究还表明该方法可满足带修饰RNA的合成，具有良好的应用前景(Organic&biomolecular chemistry,2018,16,5800
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5807；Molecules,2020,25,5492.)。
[0004]按照转录模板为线性还是环状，转录法可分为线性转录和滚环转录，滚环转录又按照转录模板为单链环还是双链环分为单链环转录和双链环转录。线性转录存在转录效率低、产物3
′
端异质(主要为[N+1]和[N+2]产物(Nucleic acids research,1987,15,8783
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8798.))，产生长链副产物(聚合酶结合在产物3
′
端进行非特异性延伸产生dsRNAs，使用时易引起免疫反应)等问题。在此过程中产物与模板对聚合酶的竞争结合会在一定程度上干扰反应(Gene,1988,72,75
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89；Proceedings of the National Academy of Sciences,1994,91,6972
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6976.))。且每个产物分子的5
′
端均带有三磷酸，其不光具有免疫原性
(Oligonucleotides,2006,16,353
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363.)，还不能被直接应用于连接(环化)反应，后期需进行去磷酸化处理。相较线性转录而言，滚环转录效率有了很大提升，且生成的长串联重复产物中仅第一个产物单元的5
′
端带有三磷酸，极大降低了免疫原性。单链环虽应用起来简便，但转录效率易受模板序列和二级结构的影响(Journal of the American Chemical Society,1995,117,7818
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7819；Molecular Therapy
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Nucleic Acids,2015,4,e215；生物技术,2016,26,7；Proceedings of the National Academy of Sciences,2002,99,54
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59；Nucleic acids research,2013,41,2552
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2564.)。使用双链环则不存在上述问题。滚环转录的效率虽高，但其生成的多聚串联重复产物只是半成品，需进行截断处理才能获得目的产物单元，但现有方法(自切割性核酶、脱氧核酶、核糖核酸酶H等)的截断效率较低、精度也较差，产物多为混合物，纯度难以满足要求(ACS nano,2019,13,4603
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4612；生物技术通报,2016,32,44
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51.)。目前几乎所有转录制备RNA的方法中所用到的模板里均含有启动子序列，这样产物中也会含有源于启动子的多余序列，后期需去除(Kristoffersson,Rolling circle transcription on smallest size double stranded DNA minicircles,A Master Thesis of Uppsala University,2010；ACS nano,2019,13,4603
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4612.)。且只要启动子处于闭合状态(启动子清空后)其就会招募新的聚合酶起始转录(造成重复起始)，而起始是整个转录过程中的限速步骤，这样势必会拖慢整体的效率(Iscience,2020,23,101445.)。多次起始产生的诸多失败转录产物(abortive transcripts，长度＜8nt)还会造成NTP的浪费。新聚合酶的起始还会干扰已处于延伸状态的聚合酶，从而影响整体的效率(J.Biol.Chem.,2006,281,24441
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24448.)。
[0005]在聚合酶链式反应(PCR)的基础上，近些年又演变出了聚合酶链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备单链RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，设计并制备环状双链DNA模板，所述环状双链DNA模板中不含启动子序列，由错配序列区域和完全互补序列区域两部分以首尾相连构成，所述错配序列区域为含有错配碱基的一段序列，其长度为5
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20bp；错配序列区域和/或完全互补序列区域含有不对称序列，不对称分三种情况：
①
序列本身不对称；
②
只在非模板链上引入修饰基团；
③
模板链和非模板链的长度不同，所设计模板须满足至少一种情况；错配序列区域的错配碱基对数占20
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100％；将所述环状双链DNA模板中的一条DNA链作为模板链，该模板链转录出的RNA产物含有目的单链RNA的序列；步骤二，设计并制备Aid
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DNA，所述Aid
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DNA为长度6
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20nt的单链DNA，所述Aid
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DNA可互补结合转录出的RNA产物的特定部位，形成DNA
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RNA双链部分，所述特定部位是指由所述模板链的错配序列区域处转录出的RNA部分；步骤三，纯化所制备的环状双链DNA模板，以去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA；步骤四，将纯化的环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、Aid
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DNA、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录和RNase H酶切，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，在转录过程中RNA聚合酶进行单向滚环转录，Aid
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DNA互补结合转录出的RNA产物的特定部位，形成DNA
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RNA双链部分，核糖核酸酶H水解与Aid
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DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，从而将含有重复序列的RNA产物进行截断，获得目的单链RNA。2.根据权利要求1所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，所述目的单链RNA的长度为50
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2000nt。3.根据权利要求1所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，所述错配序列区域的碱基错配数占比为25
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60％。4.根据权利要求1所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，所述错配序列区域的不对称性为25
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100％，所述不对称性为非回文序列长度与错配序列区域总长的比值。5.根据权利要求1
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4任一项所述的制备单链RNA的方法，其特征在于，当所述环状双链DNA模板长度小于等于70...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁兴国，陈辉，安然，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：