一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明专利技术将油相和LAMP反应溶液于微通道中混合后，切割成若干油包水的微液滴；所述微液滴平铺成单层；对所述微液滴进行LAMP反应，在LAMP反应过程中，实时监测微液滴荧光信号。基于微液滴的数字化检测方式可以有效提高新冠病毒核酸检测的灵敏度和准确度，且在待检样品的病毒浓度很低的情况下依然能快速检测出新冠病毒。冠病毒。冠病毒。

【技术实现步骤摘要】
一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，具体涉及一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法。

技术介绍

[0002]环介导等温扩增法(loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)的作用下，60～65℃恒温扩增，15～60分钟左右即可实现109～10
10
倍的核酸扩增。
[0003]LAMP操作简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应；并且，其结果的检测也很简单，通过肉眼观察白色浑浊或DNA染料荧光的生成来判断，简便快捷，非常适合快速诊断。
[0004]但是传统LAMP是定性或相对定量检测，且当样本中微生物含量过低时，LAMP检测会出现假阴性结果，LAMP的灵敏度和准确性还有待进一步提高。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法，本专利技术的方法能够实现绝对定量检测，且本专利技术的方法检测灵敏度和准确度高。
[0006]本专利技术提供了一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法，包括以下步骤：
[0007]1)将油相和LAMP反应溶液于微通道中混合后，切割成若干油包水的微液滴；所述LAMP反应溶液包括LAMP检测用试剂与待检样品；
[0008]2)将所述微液滴平铺成单层后，进行LAMP反应，实时监测微液滴荧光信号，统计有荧光的微液滴的比例；通过有荧光微液滴的比例，定量推算出目标微生物核酸分子的拷贝数。
[0009]优选的，所述LAMP检测用试剂包括针对新型冠状病毒核酸基因组的保守片段的引物。
[0010]优选的，所述新型冠状病毒核酸基因组的保守片段包括新型冠状病毒E基因。
[0011]优选的，所述LAMP检测用试剂包括用于扩增新型冠状病毒E基因的引物组；所述引物组包括F3、B3、FIP、BIP、LF和LB；所述F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示。
[0012]优选的，所述LAMP检测用试剂还包括DNA染料、脱氧尿苷5'
‑
三磷酸、尿嘧啶
‑
DNA糖基化酶、磷盐酸盐和蛋白变性剂。
[0013]优选的，所述油相为HFE 7500或FC40。
[0014]优选的，所述平铺为将所述微液滴平铺于可封闭的玻璃腔室中；所述微液滴的直径等于所述玻璃腔室的空腔高度；对所述微液滴进行LAMP反应包括对所述玻璃腔室加热至LAMP反应所需的温度后保温，触发LAMP反应。
[0015]优选的，所述微液滴的直径为100～2000μm。
[0016]优选的，所述实时监测微液滴荧光信号包括：采用imageJ对微液滴进行实时追踪，量化微液滴中的荧光信号随时间的变化。
[0017]本专利技术提供了基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法，包括以下步骤：将油相和LAMP反应溶液于微通道中混合后，切割成若干油包水的微液滴；所述微液滴平铺成单层；对所述微液滴进行LAMP反应，实时监测微液滴荧光信号。本专利技术通过将LAMP反应溶液划分在微液滴中，有效提高了局部模板浓度，从而提高了扩增效率，统计对荧光标记的阳性微滴比例即可推导出绝对核酸模板含量。本专利技术基于微液滴的数字化检测方式可以有效提高新冠病毒核酸检测的灵敏度和准确度，且在待检样品的病毒浓度很低的情况下依然能快速检测出新冠病毒。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0019]图1为本专利技术对新冠病毒核酸检测的流程示意图；
[0020]图2为所产生的微液滴的实拍图；
[0021]图3为新冠病毒核酸E基因的实时成像图；
[0022]图4为基于微液滴的实时数字LAMP对新型冠状病毒E基因的实时检测曲线；
[0023]图5为不同浓度的新冠病毒E基因的检测时间；实心柱状图代表在EP管中的检测时间，空心柱状图代表在微液滴中的检测时间。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了一种基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法，包括以下步骤：
[0025]1)将油相和LAMP反应溶液于微通道中混合后，切割成若干油包水的微液滴；所述LAMP反应溶液包括LAMP检测用试剂与待检样品；
[0026]2)将所述微液滴平铺成单层后，进行LAMP反应，实时监测微液滴荧光信号，统计有荧光的微液滴的比例；通过有荧光微液滴的比例，定量推算出目标微生物核酸分子的拷贝数。
[0027]本专利技术首先将油相和LAMP反应溶液于微通道中混合后，切割成若干油包水的微液滴；所述LAMP反应溶液包括LAMP检测用试剂与待检样品。
[0028]在本专利技术中，所述LAMP检测用试剂优选的用于对待检样品中的新冠病毒核酸进行快速扩增及检测；所述LAMP检测用试剂优选的包括针对新型冠状病毒核酸基因组的保守片段的引物。在本专利技术中，所述新型冠状病毒核酸基因组的保守片段优选的包括新型冠状病毒E基因。
[0029]在本专利技术中，所述LAMP检测用试剂优选的包括用于扩增新型冠状病毒E基因的引物组；所述引物组包括F3、B3、FIP、BIP、LF和LB；所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：TGAGTACGAACTTATGTACTCAT；所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
TTCAGATTTTTAACACGAGAGT；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTTCGTTTCGGAAGAGACAG；所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT；所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：CGCTATTAACTATTAACG；所述LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：GCGCTTCGATTGTGTGCGT。
[0030]在本专利技术中，每个引物的使用浓度优选为0.3
×
10
‑6M。当待检样品中存在新型冠状病毒时，本专利技术所述引物组能对病毒核酸进行快速扩增。
[0031]在本专利技术中，所述LAMP检测用试剂优选的还包括DNA染料、dUTP(脱氧尿苷5'
‑
三磷酸)、UDG(尿嘧啶
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DNA糖基化酶)、TCEP(磷盐酸盐)和G本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于微液滴的实时数字化LAMP核酸检测方法，包括以下步骤：1)将油相和LAMP反应溶液于微通道中混合后，切割成若干油包水的微液滴；所述LAMP反应溶液包括LAMP检测用试剂与待检样品；2)将所述微液滴平铺成单层后，进行LAMP反应，实时监测微液滴荧光信号，统计有荧光的微液滴的比例；通过有荧光微液滴的比例，定量推算出目标微生物核酸分子的拷贝数。2.根据权利要求1所述的实时数字化LAMP核酸检测方法，其特征在于，所述LAMP检测用试剂包括针对新型冠状病毒核酸基因组的保守片段的引物。3.根据权利要求2所述的实时数字化LAMP核酸检测方法，其特征在于，所述新型冠状病毒核酸基因组的保守片段包括新型冠状病毒E基因。4.根据权利要求3所述的实时数字化LAMP核酸检测方法，其特征在于，所述LAMP检测用试剂包括用于扩增新型冠状病毒E基因的引物组；所述引物组包括F3、B3、FIP、BIP、LF和LB；所述F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示。5.根据权利要求1～4任意一项所述的实时数字化LAMP核酸检测方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶方富，袁媛，张乐翔，赵远锦，
申请(专利权)人：国科温州研究院温州生物材料与工程研究所，
类型：发明
国别省市：