【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，尤其涉及一种用于检测细胞因子蛋白浓度的试剂盒及其应用。
技术介绍
1、生物标志物目前已成为临床诊断以及药物研究与开发的重要检测指标，随着生物标志物的广泛应用，越来越多的信号分子和通路被确证为药物的治疗靶点。而且生物标志物作为一种能够指示药物的生物药理活性的探针，可以精准研究药物活性，并对临床试验具有很好的预测性。
2、elisa等方法较简单，但检测灵敏度较低，可能出现假阴性；pcr技术的应用使生物检测方法研究取得一个飞跃性进展，但核酸检测并不能完全替代蛋白质的检测：药物治疗中产生的蛋白质抗原的种类和数量远远多于核酸，某些蛋白质只特异性地出现在疾病的特定阶段等，这些实际问题使得pcr等核酸检测方法的应用具有一定局限性。而邻位连接技术(proximity ligation assay，pla)是基于酶联机制和连接子而建立的一种高灵敏度的蛋白质体外分析技术。该方法首先利用一对邻位探针对靶分子进行双识别，产生可扩增的检测信号，再通过定量pcr实现定时定量检测，将对蛋白质的检测转化为对dna的检测，具有极高的灵敏性和特异性。邻位连接技术中涉及两种酶：连接酶与taq酶。这两种酶的反应条件有着很大的不同，尤其是ph，连接酶的最适ph是7.6，而taq酶的最适ph却是8.2。文献报道绝大部分也是将dna连接与pcr扩增分成两步进行。因此，将pla整合成一步法，提高检测灵敏度，简化检测步骤，缩短检测时间，在生物标志物蛋白浓度的监测分析领域将产生重要意义。
3、邻位连接技术中的邻位探针由结合部分和偶联
技术实现思路
1、本专利技术旨在提供一种用于检测细胞因子蛋白浓度的试剂盒及其应用；所述试剂盒包括两株特异性识别靶分子的单克隆抗体，二者具有不同的抗原决定簇，因而形成抗体对。这两株各修饰一段线状寡核苷酸单链的单克隆抗体，对靶分子进行双识别，产生可扩增的检测信号，再通过定量pcr实现定时定量检测，将对蛋白质的检测转化为对dna的检测。
2、本专利技术所述邻位连接技术(proximity ligation assay，pla)是基于酶联机制和连接子，本专利技术所述连接子是一种人工设计的线状寡核苷酸单链，其两端可以与邻位探针对的两条寡核苷酸链互补。当邻位探针对所含抗体对与细胞因子进行双识别时，与抗体对偶联的两条寡核苷酸链在空间上就会彼此靠近，两个寡核苷酸链的末端就可以在dna连接酶的作用下与连接子互补连接成链，而建立的一种高灵敏度的蛋白质体外分析技术。
3、为实现以上目的，本专利技术提供了以下技术方案：
4、本专利技术提供了一种用于检测细胞因子蛋白浓度的试剂盒，包括邻位探针对，所述邻位探针对由邻位探针i和邻位探针ii组成，所述邻位探针i由含有巯基基团的抗体i与5’端含有马来酰亚胺基团的寡核苷酸链i偶联而成；所述邻位探针ii由含有巯基基团的抗体ii与3’端含有马来酰亚胺基团的寡核苷酸链ii偶联而成；
5、所述寡核苷酸链i的核苷酸序列如seq id no.1、3、5、7或9所示，寡核苷酸链ii的核苷酸序列如seq id no.2、4、6、8或10所示；
6、所述抗体i和抗体ii为特异性识别所述细胞因子的单克隆抗体，二者具有不同的抗原决定簇。
7、优选的，所述邻位探针对之间通过连接子连接。
8、优选的，所述连接子序列长度在12～20nt之间。
9、优选的，所述连接子的核苷酸序列分别如seq id no.21～25所示。
10、优选的，所述邻位探针对的制备方法包括以下步骤：
11、1)将带有氨基修饰的寡核苷酸链添加至异性双功能偶联试剂中依次孵育、离心、干燥、溶解后制得含有马来酰亚胺基团修饰的寡核苷酸链溶液；
12、2)将抗体添加至2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐试剂中，依次孵育、脱盐后制得含有巯基基团修饰的待偶联抗体；
13、3)将步骤1)制得的寡核苷酸链溶液、步骤2)制得的待偶联抗体以及n-乙酰马来酰亚胺水溶液混合后过滤，制得邻位探针对。
14、优选的，所述步骤1)中带有氨基修饰的寡核苷酸链与异性双功能偶联试剂之间物质的量之比为1:2～75。
15、优选的，所述异性双功能偶联试剂为smcc或spdp交联剂。
16、优选的，所述步骤2)中抗体与2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐之间物质的量之比为1:2～50。
17、优选的，所述步骤3)中寡核苷酸链溶液、待偶联抗体以及n-乙酰马来酰亚胺水溶液的质量体积比为2～4μl:15～25μg:5～15μl。
18、本专利技术还提供了所述试剂盒在检测细胞因子蛋白浓度中的应用。
19、与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
20、(1)本专利技术将dna连接与pcr扩增合并成一步，简化了操作步骤。
21、(2)本专利技术采用sulfo-smcc与2-it试剂偶联抗体与寡核苷酸链，避免了抗体在sulfo-smcc活化过程中出现自身交联的可能。
22、(3)本专利技术设计筛选出一条杂交效率高，对后续pcr扩增干扰小的连接子序列。
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1.一种用于检测细胞因子蛋白浓度的试剂盒，其特征在于，包括邻位探针对，所述邻位探针对由邻位探针I和邻位探针II组成，所述邻位探针I由含有巯基基团的抗体I与5’端含有马来酰亚胺基团的寡核苷酸链I偶联而成；所述邻位探针II由含有巯基基团的抗体II与3’端含有马来酰亚胺基团的寡核苷酸链II偶联而成；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述邻位探针对之间通过连接子连接。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述连接子序列长度在12～20nt之间。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述连接子的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.21～25所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述邻位探针对的制备方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤1)中带有氨基修饰的寡核苷酸链与异性双功能偶联试剂之间物质的量之比为1:2～75。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述异性双功能偶联试剂为SMCC或SPDP交联剂。
8.根据权利要求5所述的
9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤3)中寡核苷酸链溶液、待偶联抗体以及N-乙酰马来酰亚胺水溶液的质量体积比为2～4μL:15～25μg:5～15μL。
10.权利要求1～9任一项所述试剂盒在检测细胞因子蛋白浓度中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测细胞因子蛋白浓度的试剂盒，其特征在于，包括邻位探针对，所述邻位探针对由邻位探针i和邻位探针ii组成，所述邻位探针i由含有巯基基团的抗体i与5’端含有马来酰亚胺基团的寡核苷酸链i偶联而成；所述邻位探针ii由含有巯基基团的抗体ii与3’端含有马来酰亚胺基团的寡核苷酸链ii偶联而成；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述邻位探针对之间通过连接子连接。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述连接子序列长度在12～20nt之间。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述连接子的核苷酸序列分别如seq idno.21～25所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述邻位探针对的...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁宇，潘伦，邹灵龙，
申请(专利权)人：国科温州研究院温州生物材料与工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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