基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白，通过分别对花生Ah10ALS2基因序列第574位和Ah20ALS2基因序列第562位进行基因编辑，Ah10ALS2基因的核苷酸序列的第574位发生C

【技术实现步骤摘要】
基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用


[0001]本专利技术涉及一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用，属于农作物遗传育种


技术介绍

[0002]花生广泛种植于热带和亚热带地区的100多个国家，是重要的油料作物和经济作物。杂草是制约花生生产的重要生物灾害之一，严重影响花生的产量和品质。提升草害防治效率对保障和稳定花生安全生产具有重要的意义。目前，我国缺乏商业化的除草剂花生品种及其配套的除草剂，这不利于我国花生产业的健康发展，因此创制具有自主知识产权、适合我国生产的抗除草剂花生品种对我国花生产业发展具有重要的意义。
[0003]ALS酶抑制类除草剂是指以乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase,ALS)为靶标的一类除草剂。ALS酶存在于植物和微生物中，由核基因编码，是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成的关键限速酶，喷施ALS酶抑制剂除草剂可使植物体内的ALS活力降低，导致上述3种支链氨基酸合成受阻，植株生长受到抑制，因此ALS酶抑制剂可以很好的杀灭杂草，不会对人和动物产生影响，具有较高的安全性。ALS酶抑制剂除草剂的选择性强，杀草谱广，能有效防除双子叶阔叶杂草，其中有些除草剂类型多单子叶禾本科植物也有较好的效果，使用的剂量较低，每亩仅需十克左右，被称作超高效除草剂，对环境友好，土壤残留期短，人畜安全，自开发以来得到了广泛的应用。ALS抑制剂类除草剂为内吸传导型，可被叶片和根系吸收，在植物内传导后在分生组织内积累，植物叶片逐渐白化或发紫，节间收缩，顶芽慢慢死亡，最终全株死亡。如今开发的ALS酶抑制剂类除草剂有13类50余种，按化学结构分为五大类：磺酰脲类(sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮类(imidazolinones,IMI)、磺酰胺基三咪唑酮类(sulfonylamino carbonyl triazolinones,SCT)嘧啶水杨酸类(pyrimidyloxy
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benzoates,PTB)和三唑嘧啶类(triazolopyrimidine,TP)。目前，商业化的SU类(ALS酶抑制剂类除草剂、磺酰脲类)除草剂是世界上开发品种最多，应用范围最广的一类除草剂，对花生具有强烈的抑制生长作用，花生药害明显，选育高效SU类除草剂抗性花生，为防除花生田杂草提供了一条新途径。然而，由于缺乏抗SU类除草剂抗性花生资源，国内至今没有培育出商业化的抗SU类除草剂抗性花生品种。因此创制有应用价值的花生抗性种质资源，对我国实现花生田间杂草化学防治具有重要的意义。
[0004]除草剂靶标ALS蛋白中氨基酸位点的替换，引起酶结构和空间构象的改变，导致蛋白和除草剂的亲和性改变，是植物产生除草剂抗性的主要原因，不同保守位点氨基酸的替换导致产生的除草剂抗性及类型有较大的的差异，决定了抗性类型和抗性水平。目前报道的ALS基因产生抗性的突变位点主要为以下几个：Ala
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122、Pro
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197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654(以拟南芥ALS氨基酸位置编号)。其中产生SU类除草剂抗性的突变位点有Ala
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122、Pro
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197、Ala205、Asp376、Trp574，Pro
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197位点的氨基酸替换可导致植物对SU类除草剂具有较高的抗性。目前通过人工诱变该位点获得了抗SU类除草剂的油
菜，如：华中农业大学和江苏农科院用EMS诱变处理油菜获得的抗苯磺隆油菜资源就产生了Pro
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197
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Ser变异，但该方法需要筛选大量突变体后代，工作量大，盲目性高。随着单碱基基因编辑技术在植物中的应用，通过单碱基突变编辑该位点，也获得了部分抗苯磺隆植物资源，如P197F、P197S的油菜、P171F的水稻、P186A的番茄。
[0005]目前，在普通花生品种或种质资源中未发现抗磺酰脲类除草剂花生资源。基因编辑技术在理论上可以对基因进行突变操作，实现对植物目标性状快速、精准改良，并且不存在传统回交育种常见的连锁等问题，大大提高育种效率。利用基因编辑手段，点突变AhALS2基因创制抗苯磺隆类除草剂花生，为花生遗传育种提供了新途径。经检索国内外现有技术，尚未发现利用CRISPR
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Cas9技术创制抗磺酰脲类除草剂花生新种质的报道。

技术实现思路

[0006]针对目前没有抗苯磺隆类除草剂花生资源，无法培育抗苯磺隆类除草剂花生品种的不足，本专利技术的目的是提供基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白及其基因在花生育种中的应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白，所述AhALS2突变型蛋白包括Ah10ALS2突变蛋白或/和Ah20ALS2突变蛋白；
[0009]Ah10ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6～8；
[0010]Ah20ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、或苯丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9～10。
[0011]一种编码所述AhALS2突变型蛋白的基因。
[0012]SEQ ID NO：6～8所示的Ah10ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示；SEQ ID NO：9～10所示的Ah20ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～5所示。
[0013]所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因在花生育种中的应用。
[0014]利用所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因建立抗苯磺隆类除草剂花生新种质的方法。
[0015]所述的方法，包括以下步骤：
[0016](1)sgRNA靶点的确定：
[0017]sgRNA靶点覆盖Ah10ALS2基因的第574位碱基和Ah20ALS2基因的第562位碱基，靶点序列3
′
端为PAM序列，所述靶点序列为5
’‑
CAGGTCCCCCGCCGCATGATTGG
‑3’
；
[0018](2)制备oligo二聚体：
[0019]设计oligo序列引物Target
‑
Sense和Target
‑
Antisense，引物离心后，分别将引物用去离子水稀释至浓度为10μM，各取1μL，加入18μL退火缓冲液，混匀；95℃保持3min后，以0.2℃/秒降温速度缓慢降至20℃，在此温度下保持5min，加水稀释至100μL，完成oligo二聚体的制备；
[0020](3)CRISPR
‑
Cas9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于基因编辑技术的AhALS2突变型蛋白，其特征在于，所述AhALS2突变型蛋白包括Ah10ALS2突变蛋白或/和Ah20ALS2突变蛋白；Ah10ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6～8；Ah20ALS2突变蛋白的氨基酸序列存在以下突变：其对应于拟南芥ALS蛋白197位氨基酸的脯氨酸变为丝氨酸、或苯丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9～10。2.一种编码权利要求1所述AhALS2突变型蛋白的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，SEQ ID NO：6～8所示的Ah10ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示；SEQ ID NO：9～10所示的Ah20ALS2突变蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4～5所示。4.如权利要求2或3所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因在花生育种中的应用。5.利用如权利要求2或3所述的编码AhALS2突变型蛋白的基因建立抗苯磺隆类除草剂花生新种质的方法。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)sgRNA靶点的确定：sgRNA靶点覆盖Ah10ALS2基因的第574位碱基和Ah20ALS2基因的第562位碱基，靶点序列3
′
端为PAM序列，所述靶点序列为5
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CAGGTCCCCCGCCGCATGATTGG
‑3’
；(2)制备oligo二聚体：设计oligo序列引物Target
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Sense和Target
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Antisense，引物离心后，分别将引物用去离子水稀释至浓度为10μM，各取1μL，加入18μL退火缓冲液，混匀；95℃保持3min后，以0.2℃/秒降温速度缓慢降至20℃，在此温度下保持5min，加水稀释至100μL，完成oligo二聚体的制备；(3)CRISPR
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Cas9重组载体的构建：选用pCSGAP01载体，加入bsal内切酶1μL，bsal内切酶的buffer缓冲液5μL，加水补齐至50μL，37℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：张新友，石磊，黄冰艳，齐飞艳，张忠信，代小冬，秦利，刘华，韩锁义，孙子淇，董文召，
申请(专利权)人：神农种业实验室，
类型：发明
国别省市：