一种N-脱氧核糖转移酶及其在脱氧核苷制备中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种N

【技术实现步骤摘要】
一种N
‑
脱氧核糖转移酶及其在脱氧核苷制备中的应用


[0001]本专利技术涉及生物酶工程
，具体涉及一种2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷的生物催化制备方法。

技术介绍

[0002]糖基上带有氟原子的核苷类化合物作为一种修饰性核苷，具有优越的生理和药理活性,在临床上被广泛用作抗癌和抗病毒药物。2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷(2'
‑
Fluoro
‑
2'
‑
Deoxyguanosine)，是2'
‑
脱氧鸟苷在糖基2'号位的氟化修饰产物，其化学结构式如式1所示。
[0003][0004]2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷作为一类新颖的核苷衍生物，可有效防止核酸酶的降解，在血清中的半衰期高达6个小时，因此具有良好的化学、酶稳定性，也是小核酸药物生产所需的基础物料之一。近几年，随着小核酸药物的迅速崛起，作为小核酸药物的重要结构性原料，2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷的市场需求量也在急速增长。一般而言，由于氟原子的特性，氟代核苷化合物的合成都较为困难，对于化合物2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷而言，已公开的合成方法均为耗时、昂贵、低效的多步骤化学合成路线，存在使用大量危险化学品、对环境不友好、不适合大规模工业化生产的问题。
[0005]N
‑
脱氧核糖转移酶能够催化脱氧核糖在不同碱基之间的转移，近年来出现了通过酶催化制备脱氧核苷类药物和中间体的报道。中国专利申请CN105754899A公开了一种N
‑
脱氧核糖转移酶酶法合成脱氧核苷的方法，其将重组表达与纯化的N
‑
脱氧核糖转移酶粗酶液，加入反应体系进行酶催化反应。中国专利申请CN114231522A公开了一种固定化的N
‑
脱氧核糖转移酶和脱氧核苷的制备方法，其通过亲和标签固定N
‑
脱氧核糖转移酶，并将固定化的N
‑
脱氧核糖转移酶加入所述反应体系，制备脱氧核苷。可见目前的用于催化的N
‑
脱氧核糖转移酶存在表达量低和/或比活力低等问题，所以催化过程需要进行酶纯化或者固定，致使脱氧核苷的制备过程成本高、反应效率低、反应周期长、产物抑制等。因此，在酶法生产脱氧核苷，包括2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷的过程中，筛选获得高表达量、高催化活性、高稳定性及不容易出现产物抑制的酶，并且开发工艺简单、底物转化率高，环境友好的催化工艺，是目前亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]基于上述技术问题，本专利技术采用分子生物学和过程优化手段对来源于乳酸乳球菌
(Lactococcus lactis，L.lactis)的脱氧核糖转移酶基因序列进行改造得到N
‑
脱氧核糖转移酶改造基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该N
‑
脱氧核糖转移酶改造基因在大肠杆菌中可较好的表达。
[0007]本专利技术还提供上述N
‑
脱氧核糖转移酶改造基因编码的蛋白，该蛋白即为N
‑
脱氧核糖转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，该N
‑
脱氧核糖转移酶对底物转化效率高且稳定性较好，在70℃下保存48h能够保留60％的活性。
[0008]本专利技术还提供了表达上述N
‑
脱氧核糖转移酶的工程菌，该工程菌可以高效表达上述N
‑
脱氧核糖转移酶，解决了现有技术中N
‑
脱氧核糖转移酶表达量低、催化活性低、催化反应所需时间长的问题。
[0009]优选技术方案中，所述工程菌由重组质粒转化至表达宿主大肠杆菌获得，所述重组质粒由SEQ ID NO:1所示的基因克隆到质粒载体上获得。进一步的，所述大肠杆菌为BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、BSR(DE3)和Shuffle T7中的一种；所述质粒载体为pET28a、pET32a和pET39a中的一种。
[0010]本专利技术提供上述N
‑
脱氧核糖转移酶、重组表达载体或重组菌在合成脱氧核苷、特别是2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷中的应用，优选技术方案为所述的重组菌或重组菌的培养物或N
‑
脱氧核糖转移酶直接催化底物合成而来。
[0011]本专利技术提供一种生产2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷的方法，表达上述N
‑
脱氧核糖转移酶的工程菌经发酵培养后，发酵液直接作为催化剂转化底物生产2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷。
[0012]优选技术方案中，应用上述N
‑
脱氧核糖转移酶生产2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷的方法，包括以下步骤：
[0013]S1：向含有脱氧核糖转移酶的发酵液中加入氯化镁和缓冲盐，制备成反应体系，并向反应体系中加入催化底物；
[0014]S2：反应液在35～80℃下反应，用碱调节反应液pH至7.0；
[0015]S3：反应结束后，煮沸5min终止反应。
[0016]进一步的，所述步骤S1中，底物为2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧尿苷，及鸟嘌呤、鸟苷和单磷酸鸟苷中的一种，其中，2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧尿苷浓度为0.2～0.5mol/L，鸟嘌呤、鸟苷和单磷酸鸟苷中的一种浓度为0.3～0.8mol/L，氯化镁的浓度为0.05
‑
0.2g/L。
[0017]进一步的，所述步骤S1中缓冲盐可以是磷酸盐和Tris
‑
HCl中的一种，其中，磷酸盐优选为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，两者浓度均为0.05～0.5mol/L，优选为所述的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠等物质量加入。
[0018]进一步的，所述Tris
‑
HCl的浓度为0.05
‑
0.5mol/L。
[0019]进一步的，所述步骤S2具体为将反应器皿置于水浴锅中调控反应温度，使反应液在35～80℃下反应，每隔4～6h用2mol/L氢氧化钠调节反应液pH，反应时间为48～120h。
[0020]进一步的，反应温度优选50℃，催化时间优选96h内。
[0021]2'
‑
氟
‑
2'本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种N
‑
脱氧核糖转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.权利要求1所述N
‑
脱氧核糖转移酶的基因，其编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体或重组菌。4.根据权利要求3所述的重组表达载体或重组菌，其特征在于，所述表达载体为质粒，优选pET28a、pET32a和pET39a中的一种；重组菌为大肠杆菌，优选BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、BSR(DE3)和Shuffle T7中的一种。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌由重组表达质粒转化大肠杆菌获得。6.权利要求1所述N
‑
脱氧核糖转移酶、权利要求3
‑
5所述重组表达载体或重组菌在合成脱氧核苷中的应用。7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述脱氧核苷为2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷。8.根据权利要求6
‑
7所述应用，其特征在于，所述脱氧核苷为权利要求3
‑
5所述的重组菌或所述重组菌的培养物或权利要求1所述N
‑
脱氧核糖转移酶直接催化合成而来。9.一种生产2'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧鸟苷的方法，其特征在于，权利要求3
‑
5所述重组表达载体或重组菌所得发酵液直接制成反应体系，一步...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，陈令伟，徐媚琪，郑玲辉，钟芳敏，罗子龙，
申请(专利权)人：杭州珲益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：