一种海藻糖合酶突变体及其制备和应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程和酶工程技术领域，公开了一种海藻糖合酶突变体,该海藻糖合酶突变体是将海藻糖合酶亲本第160、192、216、228或234位氨基酸中的一个进行点突变得到的；具体是通过设计定点突变的突变引物，以携带海藻糖合酶基因的载体为模板进行定点突变并构建含突变体的质粒载体，然后转化进宿主细胞得到；该海藻糖合酶突变体应用于海藻糖的生产。本发明专利技术海藻糖合酶突变体含有热稳定性提高的海藻糖合酶，用于生产海藻糖具有很好的工业化前景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种海藻糖合酶突变体及其制备和应用


[0001]本专利技术属于基因工程和酶工程
，特别是涉及一种海藻糖合酶突变体及其制备和应用。

技术介绍

[0002]海藻糖由两个葡萄糖分子以α
‑
1,1糖苷键连接而成，它是一种非还原性双糖，甜度约为蔗糖的45％，素有“生命之糖”的美誉，广泛存在于各种生物体中，包括细菌、酵母、真菌和藻类以及一些昆虫、无脊椎动物和植物中，尤其在酵母中含量较多，面包和啤酒等发酵食品及虾类等也含有海藻糖。
[0003]海藻糖的无还原性、高度安全性、自身结构的稳定性以及它对生物膜、蛋白质等生物大分子的非特异性保护作用，使海藻糖显示出广阔的应用前景，越来越受到研究者的关注。美国FDA在2000年将海藻糖列为安全食品，随后2001年欧洲European Regulation System也将海藻糖列为安全品，我国卫生部在2005年正式批准海藻糖为新资源食品。目前，海藻糖已经被广泛运用于食品、化妆品和医药行业。
[0004]海藻糖生产方法有酵母提取法、双酶法和单酶法。早期海藻糖是从酵母中提取的，这种工艺提取收率低，生产效率非常低下，导致海藻糖价格高达700美元/kg，目前该工艺路线已经被淘汰。1995年日本林原生化株式会社专利技术了双酶法(麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶)生产海藻糖，此工艺还需要添加普鲁兰酶和环糊精糖基转移酶，转化温度低，容易染菌，生产极其不稳定。单酶法以麦芽糖为底物，利用海藻糖合酶一步转化获得海藻糖，此工艺可以连续转化，工艺简单。单酶法工艺存在以下问题：海藻糖合酶30
‑
50℃条件下，转化率高达71
‑
80％，随着转化温度的升高，转化率呈下降趋势，60℃条件下转化率下降到66％。本行业技术人员可知，50℃以下酶转化，容易染菌，导致生产不稳定以及收率下降。因此对海藻糖合酶进行分子生物学改造，提高其高温条件下海藻糖的转化率，有利于提高单酶法生产海藻糖的效率和稳定性。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术第一个问题是：提供一种海藻糖合酶突变体，将海藻糖合酶亲本第160、192、216、228或234位氨基酸中的一个进行点突变得到的；
[0006]本专利技术所要解决的技术第二个问题是：提供一种海藻糖合酶突变体的制备方法，设计定点突变的突变引物，以携带海藻糖合酶基因的载体为模板进行定点突变并构建含突变体的质粒载体，然后转化进宿主细胞得到；
[0007]本专利技术所要解决的技术第三个问题是：提供一种海藻糖合酶突变体在海藻糖生产中的应用。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术具体的技术方案是：
[0009]一种海藻糖合酶突变体，是将氨基酸序列为序列表SEQ NO.1(NCBI登录号为BAA19934.1)的海藻糖合酶分别在第160、192、216、228或234位氨基酸中进行一个点突变得
到的；其中，突变体R160L为第160位氨基酸由精氨酸(Arg)变成异亮氨酸(Leu)，突变体D192A为第192位氨基酸由天冬氨酸(Asp)变成丙氨酸(Ala)，突变体T216N为第216位氨基酸由苏氨酸(Thr)变成天门冬酰胺(Asn)，突变体E228V为第228位氨基酸由谷氨酸(Glu)变成缬氨酸(Val)，突变体G234D为第234位氨基酸由谷氨酸(Gla)变成天冬氨酸(Asp)。
[0010]一种海藻糖合酶突变体制备方法，包括以下步骤：
[0011]a.在海藻糖合酶亲本氨基酸序列(NCBI登录号为BAA19934.1)的基础上确定第160、192、216、228或234位氨基酸为突变位点，并设计定点突变的突变引物：
[0012]引入R160L突变的定点突变引物为：
[0013]正向引物：5
’‑
AGGCCTACTACTGGCACCTCTTCTACTGGCA
‑3’
(下划线为突变碱基)
[0014]反向引物：5
’‑
GGCTGGTGCCAGTAGAAGAGGCGGTGCCAGT
‑3’
(下划线为突变碱基)；
[0015]引入D192A突变的定点突变引物为：
[0016]正向引物：5
’‑
GGGCCGACCTGGGGGTGGCCGGCTTCCGCCT
‑3’
(下划线为突变碱基)
[0017]反向引物：5
’‑
GCGTCCAGGCGGAAGCCGGCCACCCCCAGGT
‑3’
(下划线为突变碱基)；
[0018]引入T216N突变的定点突变引物为：
[0019]正向引物：5
’‑
GCGAGAACCTCCCCGAGAACATTGAGGCGGT
‑3’
(下划线为突变碱基)
[0020]反向引物：5
’‑
CGCTTCACCGCCTCAATGTTCTCGGGGAGGT
‑3’
(下划线为突变碱基)；
[0021]引入E228V突变的定点突变引物为：
[0022]正向引物：5
’‑
GCCTGAGGAAGGCCCTGGTGGAGCGCTACGG
‑3’
(下划线为突变碱基)
[0023]反向引物：5
’‑
CCGGGGCCGTAGCGCTCCACCAGGGCCTTCC
‑3’
(下划线为突变碱基)；
[0024]引入G234D突变的定点突变引物为：
[0025]正向引物：5
’‑
AGGAGCGCTACGGCCCCGTCAAGATCCTCCT
‑3’
(下划线为突变碱基)
[0026]反向引物：5
’‑
TCGGCGAGGAGGATCTTGACGGGGCCGTAGC
‑3’
(下划线为突变碱基)；
[0027]b.以表达载体TreS/pET
‑
24a(+)为模板，以步骤a的引物分别进行的PCR扩增，并将PCR产物经DpnⅠ消化后分别转入质粒载体；
[0028]c.将步骤b得到的质粒载体分别转化进宿主细胞，得到海藻糖合酶突变体，分别为突变体R160L、突变体D192A、突变体T216N、突变体E228V和突变体G234D。
[0029]优选的，所述的步骤b中表达载体TreS/pET
‑
24a(+)是含有海藻糖合酶基因的质粒TreS/pMD18T和pET24a(+)质粒分别进行NdeI和EcoRI双酶切，酶切产物割胶回收海藻糖合酶基因片段后，再用T4连接酶连接到切开的pET24a(+)质粒上得到。
[0030]优选的，所述的步骤b中的质粒载体为PUC系列、PET系列或PGEX系列中的任意一种。
[0031]进一步的，所述的步骤b中的质粒载体为PET系列质粒载体。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海藻糖合酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列为序列表SEQ NO.1的海藻糖合酶分别在第160、192、216、228或234位氨基酸中进行一个点突变得到的；其中，突变体R160L为第160位氨基酸由精氨酸变成异亮氨酸，突变体D192A为第192位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸，突变体T216N为第216位氨基酸由苏氨酸变成天门冬酰胺，突变体E228V为第228位氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸，突变体G234D为第234位氨基酸由谷氨酸变成天冬氨酸。2.如权利要求1所述的海藻糖合酶突变体制备方法，其特征在于：包括以下步骤：a.在序列表SEQ NO.1海藻糖合酶氨基酸序列的基础上确定第160、192、216、228或234位氨基酸为突变位点，并设计定点突变的突变引物：引入R160L突变的定点突变引物为：正向引物：5
’‑
AGGCCTACTACTGGCACCTCTTCTACTGGCA
‑3’
(下划线为突变碱基)反向引物：5
’‑
GGCTGGTGCCAGTAGAAGAGGCGGTGCCAGT
‑3’
(下划线为突变碱基)；引入D192A突变的定点突变引物为：正向引物：5
’‑
GGGCCGACCTGGGGGTGGCCGGCTTCCGCCT
‑3’
(下划线为突变碱基)反向引物：5
’‑
GCGTCCAGGCGGAAGCCGGCCACCCCCAGGT
‑3’
(下划线为突变碱基)；引入T216N突变的定点突变引物为：正向引物：5
’‑
GCGAGAACCTCCCCGAGAACATTGAGGCGGT
‑3’
(下划线为突变碱基)反向引物：5
’‑
CGCTTCACCGCCTCAATGTTCTCGGGGAGGT
‑3’
(下划线为突变碱基)；引入E228V突变的定点突变引物为：正向引物：5
’‑
GCCTGAGGAAGGCCCTGGTGGAGCGCTACGG
‑3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟杰，景栋，徐明，
申请(专利权)人：潍坊盛泰药业有限公司，
类型：发明
国别省市：