一种获得抗草甘膦水稻的方法及其所用双碱基融合编辑系统技术方案

本发明专利技术公开了一种获得抗草甘膦水稻的方法及其所用双碱基融合编辑系统。本发明专利技术公开的获得抗草甘膦水稻的方法，包括：利用双碱基融合编辑系统(STCBE)将受体水稻中的EPSPS基因通过基因编辑突变为EPSPS

【技术实现步骤摘要】
一种获得抗草甘膦水稻的方法及其所用双碱基融合编辑系统


[0001]本专利技术涉及分子育种领域中，一种获得抗草甘膦水稻的方法及其所用双碱基融合编辑系统。

技术介绍

[0002]水稻是我国重要的口粮作物，提高水稻产量和品质将对缓解世界粮食危机和保障粮食安全具有十分重要的意义。然而，在水稻的生产过程中，农田杂草与水稻竞争阳光、水分、养分及生长空间，同时又是作物病原菌及害虫的中间寄主，严重影响水稻的产量与品质。有效控制田间杂草是促进粮食增产，增加农民收入，确保粮食安全的重要措施之一。因此，开发广谱、高效、低毒、易降解、无残留等灭生性除草剂或选择性除草剂耐性作物具有非常广阔的应用价值和市场潜力。
[0003]单碱基编辑技术(Base editing)是基于CRISPR系统的新型靶基因定点修饰技术，在不产生DNA双链断裂的情况下，利用胞嘧啶脱氨酶或人工进化的腺嘌呤脱氨酶对靶位点进行精准的单碱基编辑，从而实现单核苷酸改变以产生功能获得性突变，可以加速作物的从头驯化或定向进化。单碱基编辑的工作最早来自David Liu实验室，利用活性受损的CRISPR/Cas核酸酶(无诱导DNA双链断裂的能力)与胞嘧啶脱氨基酶(Cytosine deaminase)以及尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白(UGI)融合实现C>T的编辑(Komor et al.2016)。现有的单碱基编辑器有三大类：第一类是融合胞嘧啶脱氨酶和UGI的胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE)，可催化C>T碱基的转换；第二类则是融合脱氧腺嘌呤脱氨基酶(Adenine deaminase)的腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)，可实现A>G碱基的转换；第三类是是融合胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基转移酶(UNG)的碱基编辑器(C to G base editor,CGBE)，可催化C>G碱基的颠换。CBE系统能催化碱基C脱氨基变成U，而U在DNA复制过程中会被识别成T，经DNA修复和复制后实现C>T的转换(Komor et al.2016)。CBE通常要与UGI融合，UGI能防止细胞内的尿嘧啶糖基化酶将碱基U糖基化引起碱基切除修复，阻止UG逆转成CG，从而提高C向T的转换效率。ABE系统在腺嘌呤脱氨酶的作用下将A脱氨变为I，经DNA修复和复制后实现A向G的转换。在实际应用过程中，常将两个腺嘌呤脱氨酶TadA串联成二聚体的形式进行使用(Gaudelli et al.2017)。为了拓展单碱基编辑系统的编辑范围，研究者使用尿嘧啶糖基转移酶(UNG)代替UGI，UNG可以切除脱氨酶产生的碱基U，形成一个无嘌呤和无嘧啶位点，启动DNA修复过程，实现了C>G的颠换，将这种新型碱基编辑器命名为CGBE系统(Zhao et al.2021；Tian et al.2022)。利用脱氨酶
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nCas9或脱氨酶
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dCas9的融合，单碱基编辑系统已成功应用于多种重要农作物，如水稻、小麦、玉米、大豆和棉花等作物。
[0004]为了提高单碱基编辑系统的效率，David Liu实验室突变了TadA的8个氨基酸位点(TadA8e)，在哺乳细胞中检测到的脱氨速度比之前的野生型脱氨酶TadA快近千倍，大大提高了碱基编辑效率(Richter et al.2020)。之后将Tad8e应用到水稻中，编辑效率显著提升，有的位点编辑效率甚至能达到100％(Wei et al.2021)。此外，为了在植物中获得更高活性的碱基编辑器，刘耀光团队成功开发了一套高效、广靶向的植物胞嘧啶单碱基编辑器
PevoFERNY
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NG，在水稻的NGG
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PAM和NG
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PAM靶点都有较高的编辑效率(Zeng et al.2020)，其中evoFERNY是一种进化脱氨酶，比APOBEC1蛋白更小，并能够在所有测试的序列背景中进行有效编辑。
[0005]植物定向进化的饱和靶向内源诱变编辑器(Saturated Targeted Endogenous Mutagenesis Editor,STEME)的出现，加快了农作物性状的发展与进化，为快速获得新的优良农艺性状提供了可能(Li et al.2020)。研究者将胞嘧啶脱氨酶hA3A和腺嘌呤脱氨酶TadA二聚体同时融合在nCas9(D10A)的N端，并将UGI以融合或自由表达的形式置于nCas9(D10A)的C端。STEME双碱基编辑器只在一个sgRNA引导下就可以诱导靶位点C>T和A>G的同时突变，显著增加了靶基因碱基突变的饱和度及产生突变类型的多样性。该研究应用STEME系统在水稻中定向进化OsACC(Acetyl
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coenzyme A carboxylase)基因获得了除草剂抗性系列突变体。此外，在前期开发的一系列单碱基编辑器基础之上，提出了单碱基编辑技术介导的水稻内源靶标基因的定向进化技术理念，在水稻细胞内人工模拟自然界基因的长期进化过程，短时间内创制大量除草剂抗性基因OsALS(Acetolactatesynthase)的新等位基因材料(Kuang et al.2020)。通过除草剂抗性筛选，研究人员成功鉴定出4个自然界中未曾被发现的、对除草剂具有不同抗性程度的OsALS新等位基因；并通过单碱基编辑技术引入到水稻生产品种南粳46中，将其升级为通过苗期一、两次施药，生育期田间无杂草发生的“洁田稻”。但目前开发的用于定向进化的碱基编辑器，效率较低，且由于PAM限制，靶点选择有限，有时不能在编码区和启动子区做到全覆盖，进而影响了其应用。
[0006]草甘膦是目前使用最广泛的广谱灭生性除草剂，培育抗草甘膦基因编辑水稻对改善稻田杂草化学防控效果、减少用药量和简化防控措施有重要意义。草甘膦高效且低残留，杂草不易对其产生抗性，成本较低且易于在环境中降解。草甘膦作用于植物体内莽草酸途径的5
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烯醇式丙酮酸
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磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)，干扰EPSPS正常酶活功能，阻碍酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等植物生长必需氨基酸的正常合成而影响植物的生长发育，导致死亡(Baerson et al.2002)。目前，培育抗草甘膦农作物品种常用的方法是应用转基因手段将来自外源的草甘膦抗性基因导入农作物中，使其在农作物中表达，从而培育出抗草甘膦作物新品种。但是由于转基因作物的商业化审批严格，目前我国尚未有转基因粮食作物商业化生产的报道。因此，开发高效碱基编辑器，以水稻内源EPSPS基因为靶标基因，通过碱基编辑器介导的定向进化，开发抗草甘膦的新型等位基因资源和新型无转基因抗草甘膦水稻新种质，对提升稻田杂草的综合治理效果，实现水稻轻简化，保障粮食安全具有重要意义。截至目前，相关研究尚未见国内外报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的一个技术问题是如何培育抗草甘膦水稻。
[0008]为解决本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.培育抗草甘膦水稻的方法，包括：将受体水稻中的EPSPS基因通过基因编辑突变为EPSPS
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1422C>T基因，得到抗草甘膦水稻；所述EPSPS基因编码如下A1)或A2)的EPSPS蛋白质：A1)序列表中序列12所示的EPSPS蛋白质；A2)将序列表中序列12所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、第213位为天冬氨酸残基且具有相同功能的EPSPS蛋白质；所述EPSPS
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1422C>T基因编码如下B1)或B2)的EPSPS
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D213N蛋白质：B1)序列表中序列13所示的EPSPS
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D213N蛋白质；B2)将序列表中序列13所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、第213位为天冬酰胺残基且具有相同功能的EPSPS
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D213N蛋白质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述EPSPS基因为如下a11)或a12)：a11)序列表中序列10所示的DNA分子；a12)与a11)具有75％或75％以上同一性，且编码所述EPSPS蛋白质的DNA分子；所述EPSPS
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1422C>T基因为如下b11)或b12)：b11)序列表中序列11所示的DNA分子；b12)与b11)具有75％或75％以上同一性，且编码所述EPSPS
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D213N蛋白质的DNA分子。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述基因编辑采用双碱基融合编辑系统进行，所述双碱基融合编辑系统包括evoFERNY、TadA8e、nCas9
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NG(D10A)和2
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UGI，所述2
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UGI由两个UGI连接得到；进一步，所述evoFERNY为序列表中序列5的第9
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169位所示的蛋白质；和/或，所述TadA8e为序列表中序列5的第218
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383位所示的蛋白质；和/或，所述nCas9
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NG(D10A)为序列表中序列5的第416
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1782位所示的蛋白质；和/或，所述UGI为序列表中序列5的第1793
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187...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏兰琴，张臣，林勇，张阳军，钟雪，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：