一种胞外分泌量和分泌速度增强的淀粉分支酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种胞外分泌量和分泌速度增强的淀粉分支酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明专利技术的淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的前6位的氨基酸截断突变得到的，本发明专利技术通过先疏水柱后离子柱的二步纯化方式，对淀粉分支酶突变体酶蛋白进行分离纯化。本发明专利技术所得的淀粉分支酶突变体ΔNloop在72h的胞外酶活提高17.29％，同时胞外分泌速度得到极大提升，在48h可以将胞内目标蛋白完全分泌至胞外，进一步促进了淀粉分支酶在食品级枯草芽孢杆菌表达系统中的高效表达。达系统中的高效表达。达系统中的高效表达。

【技术实现步骤摘要】
一种胞外分泌量和分泌速度增强的淀粉分支酶突变体


[0001]本专利技术涉及一种胞外分泌量和分泌速度增强的淀粉分支酶突变体，属于基因工程和酶工程


技术介绍

[0002]淀粉分支酶(1，4
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α
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glucan branching enzyme，GBE)是一类葡萄糖基转移酶，以葡聚糖分子为底物，同时具备“水解”、“转移”、“合成”三个功能。根据氨基酸序列的相似性，淀粉分支酶又被归类为糖苷水解酶(Glycoside hydrolases，GHs)。GBE可以通过水解淀粉中的α
‑
1,4
‑
糖苷键，并将具有非还原末端的糖链以α
‑
1,6
‑
糖苷键的形式连接至受体链上，形成新的α
‑
1,6
‑
分支点，增加淀粉的分支度，提高淀粉的抗消化性和慢消化性。由于GBE这种独特的提高淀粉分支度的特性，可以用来制备高支化淀粉及淀粉衍生物，具有极大的工业应用前景。
[0003]淀粉分支酶一般来源于植物，动物和微生物中。植物来源的淀粉分支酶最为常见，但其在改性淀粉过程中涉及多种同工酶的协同催化，较为复杂，因此不适合工业化生产；动物来源的淀粉分支酶在发酵生产过程中异源表达相对困难。相比而言，微生物来源的淀粉分支酶最适反应温度较高、特异性强、分支化度大、催化方式简单，且易于基因操作，因而在工业化生产中有较大优势。微生物中淀粉分支酶一般来源于细菌(如蓝藻细菌、嗜热球菌、大肠杆菌)以及真菌(酿酒酵母、构巢曲霉)。
[0004]一般自然菌株产生分支酶能力较低，需要对产酶条件进行优化，才能到达较高的产酶水平。酶的工业化应用往往受限于酶的低表达量及复杂的酶分离过程等因素。近年来，国内外许多研究通过基因工程技术实现了淀粉分支酶的异源表达，显著提高了淀粉分支酶的表达量。然而，大多数的报道都是以大肠杆菌作为宿主，而大肠杆菌及易形成包涵体，分离较为困难。同时，大肠杆菌本身含有的内毒素严重限制了淀粉分支酶在食品领域的应用。
[0005]因此，将具有良好应用前景的淀粉分支酶安全地进行表达，并探索一种更具有针对性的高效表达策略，是如今值得探索的方向。通过基因工程和酶工程等手段实现淀粉分支酶的高效表达和分离，并将其应用于食品领域，对于淀粉分支酶的工业化应用具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术中存在的淀粉分支酶的胞外分泌能力差等问题，本专利技术通过对来源于热葡萄糖苷地杆菌Geobacillus thermoglucosidans STB02编码的淀粉分支酶进行截断突变得到。
[0007]本专利技术提供了一种胞外表达量和分泌速度显著提高的突变体ΔNloop，在72h的胞外酶活提高17.29％，同时胞外分泌速度得到极大提升，进一步促进了淀粉分支酶在食品级枯草芽孢杆菌表达系统中的高效表达。
[0008]本专利技术提供了一种淀粉分支酶突变体ΔNloop，所述淀粉分支酶突变体是将氨基
酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的前6位的氨基酸截断突变得到的。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体ΔNloop的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体ΔNloop的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所示淀粉分支酶亲本酶为来源于热葡萄糖苷地杆菌Geobacillus thermoglucosidans STB02，编码所述淀粉分支酶亲本酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
[0012]本专利技术还提供了一种编码上述淀粉分支酶突变体ΔNloop的基因。
[0013]本专利技术还提供了一种携带上述基因的重组载体。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组载体是pP43NMK为表达载体。
[0015]本专利技术还提供了一种携带上述基因，或上述重组载体的重组细胞。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，以细菌或真菌为宿主细胞。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌为宿主细胞。
[0018]本专利技术还提供了一种重组菌，所述重组菌以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌为宿主，表达了上述淀粉分支酶突变体ΔNloop。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，以Bacillus subtilis WB600为宿主。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，以pP43NMK为表达载体。
[0021]本专利技术还提供了一种提高淀粉分支酶胞外分泌量和分泌速度的方法，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的前6位氨基酸进行截断突变。
[0022]本专利技术还提供了一种合成支链淀粉的方法，其特征在于，将上述淀粉分支酶突变体，或上述重组细胞添加至含有直链淀粉的反应体系中，反应制备得到支链程度提高的淀粉。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述直链淀粉为0.1％(w/v)马铃薯支链淀粉。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体的添加量为：0.1mg/mL。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应条件为：40～60℃反应1～2h。
[0026]本专利技术还提供了一种纯化淀粉分支酶的方法，所述方法为，将上述野生型，或上述突变体通过先过疏水柱，再过离子柱的两步方法进行纯化。
[0027]有益效果
[0028](1)本专利技术通过将来源于热葡萄糖苷地杆菌Geobacillus thermoglucosidans STB02的淀粉分支酶的前6位氨基酸进行截断突变，显著提高了热葡萄糖苷地杆菌来源淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌及大肠杆菌中的胞外表达水平，本专利技术的方法安全、高效，其制备得到的含有淀粉分支酶突变体ΔNloop发酵72h的粗酶液活力与原始酶相比，提高了17.29％，且在48h开始可以完全将胞内酶分泌至胞外，显著提高了胞外分泌速度；并且采用本专利技术的方法获得的重组酶是胞外酶，有利于后期大规模生产的提取纯化，产品符合食品要求。
[0029](2)本专利技术促进了淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌中的胞外分泌表达，且表达水平较高，这在一定程度上创新了淀粉分支酶在食品级枯草芽孢杆菌表达系统中的现有表达水平，可进一步促进淀粉分支酶在食品工业中的生产应用。
[0030](3)本专利技术通过二步纯化的方法，即先疏水柱纯化，后离子柱纯化的方法，能够有效的得到淀粉分支酶的纯酶蛋白，在不使用镍柱的情况下，更适合应用于食品领域，具有较高的食品领域的应用潜力。
附图说明
[0031]图1：野生型和突变体粗胞外胞内蛋白的SDS PAGE电泳分析，其中，条带Marker：蛋白标准分子量；ΔNloop,ΔN
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15aa,ΔN
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20aa,ΔN
‑
30aa为Gt
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高淀粉分支酶胞外分泌量和分泌速度的淀粉分支酶突变体，其特征在于，所述淀粉分支酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.编码权利要求1所述淀粉分支酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的重组载体。4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述重组载体的重组细胞。5.如权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，以细菌或真菌为宿主细胞。6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌或大肠杆菌。7.一种提高淀粉分支酶胞外分泌量和分泌速度的方法，其特征在于，将氨基酸序列为SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：班宵逢，徐涛，李兆丰，李才明，顾正彪，程力，洪雁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：