基于基因编辑技术的制造技术

本发明专利技术涉及一种基于基因编辑技术的

【技术实现步骤摘要】
基于基因编辑技术的AhFAD2基因及其在高油酸花生育种中的应用


[0001]本专利技术涉及一种基于基因编辑技术的
AhFAD2
基因及其突变型在花生育种中的应用，属于农作物遗传育种

。

技术介绍

[0002]花生
(Arachis hypogaea L.)
是世界上重要的油料作物之一，广泛种植于热带
、
亚热带和温带地区
。
我国是世界上最大的花生生产国和消费国，产量占世界总产量的
40
％左右，其中一半用来榨油
。
普通花生籽仁的油酸含量在
37
～
55
％之间，高油酸花生油酸含量大于
75
％
。
油酸比亚油酸具有更高的营养
、
保健价值和更稳定的化学性质，并且具有更好的风味，高油酸花生及其制品不易酸败，延长了货架期，因此油酸含量决定了花生油的品质，是评价花生品质的重要指标
。
创制高油酸花生种质资源及培育
、
推广高油酸品种成为当前花生遗传改良的热点和重要目标，受到了育种家的高度关注
。
[0003]Δ
12
‑
脂肪酸脱氢酶基因
(delta
‑
12fatty aciddesaturase 2,FAD2)
在内质网中通过催化油酸脱去
C12
上的2个氢引入双键生成亚油酸，拟南芥
fad2r/>突变体中的油酸含量显著高于野生型拟南芥，同时亚油酸含量显著低于野生型拟南芥，
FAD2
是决定油酸含量的关键基因
。
研究发现，大豆
、
油菜
、
向日葵等突变体的高油酸性状也是由于
FAD2
基因功能丧失导致的
。
遗传分析表明花生高油酸性状由1对
AhFAD2
‑
1A/B
控制，该基因包含2个外显子和1个内含子，其中外显子Ⅰ和内含子位于起始密码子上游的非翻译区，外显子Ⅱ包含了整个
ORF
区，当
AhFAD2
‑
1A
基因在
448bp
处发生碱基
G
‑
A
突变，导致
AhFAD2
‑
1A
脱氢酶功能降低，同时
AhFAD2
‑
1B
在
441bp
后插入碱基
A
导致
AhFAD2
‑
1B
提前终止或在
665
和
997bp
处插入微型反向重复转座元件
(MITE)
导致
AhFAD2
‑
1B
翻译不完全，从而引起花生的高油酸
。Wen
等通过
TALEN
介导花生
FAD2
突变也证明了
FAD2
突变是引起高油酸的原因
。
[0004]高油酸花生种质资源匮乏，通过分析我国花生品种和微核心种质，发现
AhFAD2
‑
1A
存在
448
位置上
G
‑
A
突变类型，
AhFAD2
‑
1B
基因相对保守，未见发生突变的相关报道
。
[0005]当前广泛应用的高油酸亲本材料中的
AhFAD2
‑
1A
突变类型均为
448
位置上
G
‑
A
突变类型，
AhFAD2
‑
1B
突变类型有两种，一种为自发突变产生的在起始密码子后第
442
位置上
A
插入类型，导致移码突变，另一种为由化学诱变引起
205bp
的
MITE
插入类型，该突变类型有两个插入位点，一个位于起始密码子后第
997
位置，另一个位于起始密码子后第
665
位置
。
这些突变体材料遗传背景单一，存在生育期长
、
蔓生或半蔓生
、
果荚小
、
抗病耐逆性差等不良农艺性状，不宜在我国花生育种中直接应用
。
尽管通过分子标记辅助连续回交育种改良了部分品种，但存在回交世代长
、
工作量大
、
容易丢失优良性状
、
与轮回品种有差异等问题，制约了利用传统育种技术改良花生高油酸性状的效率
。
因此，创制新的农艺性状优异的高油酸花生突变体对拓展高油酸品种的遗传背景
、
提高优良性状聚合的效率具有重要意义
。

技术实现思路

[0006]针对目前高油酸花生资源存在的问题，本专利技术提供一种基于基因编辑技术的
AhFAD2
基因突变体，并提供了该基因突变体在花生高油酸育种中的应用
。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]一种基于基因编辑技术的
AhFAD2
突变型基因，所述
AhFAD2
突变型基因包括
AhFAD2
‑
A
基因突变或
/
和
AhFAD2
‑
B
基因突变；
[0009]AhFAD2
‑
A
基因突变序列存在以下突变：对应于野生型花生
AhFAD2
‑
A
序列的
46
～
68
位之间的编辑靶标序列插入或缺失3的非整数倍的碱基数，导致之后的氨基酸序列移码突变；
[0010]AhFAD2
‑
B
基因突变序列存在以下突变：对应于野生型花生
AhFAD2
‑
B
序列的
46
～
68
位之间的编辑靶标序列插入或缺失3的非整数倍的碱基数，导致之后的氨基酸序列移码突变
。
[0011]AhFAD2
‑
A
基因突变后的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
～5所示；
AhFAD2
‑
B
基因突变后的核苷酸序列如
SEQ ID NO.6
～
11
所示
。
[0012]同时本专利技术提供了，
AhFAD2
突变型基因在花生育种中的应用
。
[0013]更进一步的，
AhFAD2
突变型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于基因编辑技术的
AhFAD2
突变型基因，其特征在于，所述
AhFAD2
突变型基因包括
AhFAD2
‑
A
基因突变或
/
和
AhFAD2
‑
B
基因突变；
AhFAD2
‑
A
基因突变序列存在以下突变：对应于野生型花生
AhFAD2
‑
A
序列的
46
～
68
位之间的编辑靶标序列插入或缺失3的非整数倍的碱基数，导致之后的氨基酸序列移码突变；
AhFAD2
‑
B
基因突变序列存在以下突变：对应于野生型花生
AhFAD2
‑
B
序列的
46
～
68
位之间的编辑靶标序列插入或缺失3的非整数倍的碱基数，导致之后的氨基酸序列移码突变
。2.
如权利要求1所述的
AhFAD2
突变型基因，其特征在于，
AhFAD2
‑
A
基因突变后的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
～5所示；
AhFAD2
‑
B
基因突变后的核苷酸序列如
SEQ ID NO.6
～
11
所示
。3.
如权利要求1或2所述的
AhFAD2
突变型基因在花生育种中的应用
。4.
如权利要求1或2所述的
AhFAD2
突变型基因在高油酸花生育种中的应用
。5.
如权利要求1或2所述的基于基因编辑技术的
AhFAD2
突变型基因建立的高油酸花生新种质的方法
。6.
如权利要求5所述的基于基因编辑技术的
AhFAD2
突变型基因获得高油酸花生新种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)sgRNA
靶点的确定
sgRNA
靶点覆盖
AhFAD2
‑
A
基因和
AhFAD2
‑
B
基因的第
46
‑
68
位之间碱基，靶点序列3′
端为
PAM
序列，所述靶点序列为5′‑
GAATGTGGAACCCTTGAAAGAGG
‑3′
；
(2)
制备
oligo
二聚体设计
oligo
序列引物
Target
‑
Sense
和
Target
‑
Antisense
，引物离心后，分别将引物用去离子水稀释至浓度为
10
μ
M
，各取1μ
L
，加入
18
μ
L
退火缓冲液，混匀；
95℃
保持
3min
后，以
0.2℃/
秒降温速度缓慢降至
20℃
，在此温度下保持
5min
，加水稀释至
100
μ
L
，完成
oligo
二聚体的制备；
(3)CRISPR
‑
Cas9
基因编辑重组载体的构建选用
pCSGAP01
载体，加入
bsal
内切酶1μ
L、bsal
内切酶的
buffer
缓冲液5μ
L
，加水补齐至
50
μ
L
，
37℃
酶切
1h
；回收酶切后的线性化载体2μ
L
及
infusio...

【专利技术属性】
技术研发人员：张新友，石磊，黄冰艳，孙子淇，张忠信，代小冬，齐飞艳，秦利，徐静，刘华，韩锁义，董文召，
申请(专利权)人：神农种业实验室，
类型：发明
国别省市：