用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列及其应用，该内参序列为

【技术实现步骤摘要】
用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程

。
具体地说是一种用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列及其应用
。

技术介绍

[0002]流产性转录本
(AT)
又被称为转录中断物，是指在转录的起始阶段由
RNA
聚合酶重复合成并释放的大量含2～
10
个核酸碱基
(2
～
10nt)
的寡聚核苷酸序列
。
流产性转录本的长度一般不超过
10nt
，一些突变基因的流产性转录本最长可达
19nt。1976
年，流产性转录本第一次在体外转录实验中被发现
。1980
年，
Carpousis
等正式将其命名为流产性转录本
。
研究者通过体外实验发现，流产性起始现象普遍发生在一切以
RNA
聚合酶
(
包括
DNA
依赖和
RNA
依赖的
RNA
聚合酶
)
为特征生物的每一次转录中
。
在大肠杆菌
、
体外培养的人体细胞
、
细胞上清液
、
细胞上清液外泌体
、
小鼠血浆和小鼠血浆外泌体等中也检测到了流产性转录本的存在
。
[0003]2011
年
,Goldman
>等发现在大肠杆菌体内的
RNA
聚合酶利用2～
4nt
人工合成的流产性转录本引发转录起始
,
同时发现能作为引物的流产性转录本在序列和长度上有着极其严苛的要求，这说明流产性转录本可能有着重要的生物学作用
。
为了研究流产性转录本的生物学作用，通常要对流产性转录本进行检测
。
[0004]目前对流产性转录本的检测主要依赖放射性自显影技术，该方法基于特定转录模板和
P
32
标记的
NTP
，在体外转录合成流产性转录本，然后利用放射性自显影鉴定流产性转录本的长度和含量
。
但这项技术无法对流产性转录本的序列进行鉴别，更无法对机体内自然生成的流产性转录本进行定性和定量分析
。
[0005]RNA
在被反转录成
cDNA
后，则可用实时荧光定量
PCR(qPCR)
技术
(
如经济
、
快速且灵敏度高的
SYBRGreen qPCR
，特异性高
、
检测结果准确可靠的
TaqMan
‑
MGB qPCR)
或高通量的二代测序技术等，对其进行检测
。
但是，流产性转录本
RNA
片段较短，对其进行反转录较为困难
。
[0006]为了将短链
RNA
反转录为
cDNA
，可以先设法将其延长
。
短链
RNA
介导连接反应法是一种延长目标短链
RNA
的方法，该方法需要使用
T4 DNA
连接酶
。T4 DNA
连接酶能够修复双链
RNA、DNA
或
DNA/RNA
杂合体中的单链缺刻，也有将
DNA
片段的粘性末端或平末端连接在一起的作用
。T4 DNA
连接酶对单链游离核酸没有活性
。
利用以上
T4 DNA
连接酶的功能特点，可设计出两条各覆盖目标短链
RNA
一半序列的单链
DNA
探针，在碱基互补配对作用下，该目标短链
RNA
会与两条单链
DNA
探针形成
DNA/RNA
杂合体，两条单链
DNA
探针之间存在一缺刻，该缺刻可被
T4 DNA
连接酶连接，连接后即可得到完整探针，通过检测完整探针的含量可以确定短链
RNA
的含量
。
但是，此类方法或者需要设计覆盖小
RNA
的引物以保证检测的特异性，或者需要短链
RNA
能同时与两条探针稳定的结合，而流产性转录本由于长度太短，所以并不能用上述方法进行检测
。
[0007]专利文献
CN 108384831A
中公开了一种将寡聚核苷酸逆转录成
cDNA
的方法，可用于将流产性转录本转录为
cDNA
，被逆转录出的
cDNA
可用作
qPCR
的模板
。
但是，若要使用
qPCR
对流产性转录本进行相对定量检测，还需要能在体内表达量较为稳定的内参基因
(
内参序列
)。
[0008]目前的研究表明，
Gapdh
基因可作为小鼠
RNA
样品中实时荧光定量
PCR(qPCR)
的内参基因，用于分析各目的基因在实验组与对照组中的相对表达量情况，即
Gapdh
基因在小鼠体内的表达量是相对稳定的
。
但
Gapdh
的流产性转录本作为小鼠体内流产性转录本相对定量检测的内参序列却未有报道
。

技术实现思路

[0009]为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列及其应用，以用于小鼠体内不同基因产生的寡聚核苷酸相对含量的检测
。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0011]用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列，为
Gapdh
基因转录过程中产生的流产性转录本，流产性转录本的核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。
[0012]用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列的应用，利用上述用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列逆转录出的核苷酸序列定量检测小鼠体内寡聚核苷酸；流产性转录本
SEQ ID NO.5
逆转录出的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。
由于流产性转录本
SEQ ID NO.5
在小鼠体内的含量较为稳定，其作为寡聚核苷酸定量检测的内参序列有利于小鼠体内其他流产性转录本的相对定量检测，所得的实验结果准确性较好
。
[0013]上述的用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列的应用，利用荧光定量
PCR
检测小鼠体内寡聚核苷酸
。
[0014]上述的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列，其特征在于，为
Gapdh
基因转录过程中产生的流产性转录本，流产性转录本的核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。2.
用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列的应用，其特征在于，利用如权利要求1所述的用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列逆转录出的核苷酸序列定量检测小鼠体内寡聚核苷酸；流产性转录本
SEQ ID NO.5
逆转录出的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。3.
根据如权利要求2所述的用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列的应用，其特征在于，利用荧光定量
PCR
检测小鼠体内寡聚核苷酸
。4.
根据如权利要求3所述的用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列的应用，其特征在于，荧光定量
PCR
检测过程中所用上游引物
F1
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.8
所示，下游引物
R1
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.9
所示
。5.
根据如权利要求3所述的用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列的应用，其特征在于，荧光定量
PCR
检测过程中使用的探针的核苷酸序列如
SEQ ID NO.7
所示
。6.
根据如权利要求5所述的用于小鼠体内寡聚核苷酸定量检测的内参序列的应用，其特征在于，探针的5’
端连接有荧光报告基团，3’
端连接有荧光淬灭基团；荧光报告基团为
FAM
，荧光淬灭基团为
MGB。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：闫伟伟，赵利峰，吴海柱，李才林，秦少伟，
申请(专利权)人：桂林旅游学院，
类型：发明
国别省市：