用于合成复杂香豆素的制造技术

本发明专利技术公开了用于合成复杂香豆素的

【技术实现步骤摘要】
用于合成复杂香豆素的CYP450环化酶基因PpDC与PpOC及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其涉及用于合成复杂香豆素的
CYP450
环化酶基因
PpDC
与
PpOC
及其应用
。

技术介绍

[0002]伞形科植物白花前胡的干燥根为化痰止咳平喘的常用中药前胡，前胡具有降气化痰
、
散风清热的功效，现代药理研究表明其具有钙拮抗剂
、
降压
、
抗肿瘤
、
抗病毒
、
抗炎及逆转肿瘤多药耐药等多种药理作用
。
目前，由于人类的大量开采，野生前胡的产量已经难以满足日益增长的市场需求
。
尽管许多地方已有人工栽培，但是由于人工种植的前胡在第二年就开花，其品质受到严重影响，并且前胡种植对土质和环境的要求较高，人工成本也随之升高，因此，探索其他高效的生产方式刻不容缓
。
[0003]近年来，分子生物学及代谢工程的兴起给人们带来了新的思路与出路
。
其基本观点是应用代谢工程的方法在生物体或细胞器
(
比如大肠杆菌，酵母菌
)
的水平上生产药用有效成分，该技术的发展主要受限于难以找到合成药用有效成分的关键蛋白酶及编码它们的基因
。
但该法具有耗时少
、
单位产量大
、
不受季节
、
气候等自然条件的影响等优势，因此，利用分子生物学和代谢工程技术生产药物有效成分具有广泛的应用前景
。
[0004]香豆素类化合物是前胡主要的物质基础，是一大类次生代谢物，在结构上，香豆素具有常见的
1,2
‑
苯并吡咯酮骨架，一般分为简单香豆素
、
线型呋喃香豆素
、
线型吡喃香豆素
、
角型吡喃香豆素
、
角型呋喃香豆素等
。
虽然香豆素的结构骨架不是很复杂，但其生物合成机制仍不明确
。
环化是呋喃香豆素和吡喃香豆素骨架生物合成的最后一步，也是决定香豆素化学多样性的一个重要酶
。
然而，到目前为止，只在桑科中克隆到了一个负责线型呋喃香豆素生物合成的基因，在伞形科和芸香科中未见报道
。
此外，不同类型的香豆素的环化机制以及植物进化产生不同类型的香豆素的机制仍不清楚
。
因此，获得环化酶基因并进行功能验证，对于了解香豆素的化学多样性机制意义重大，同时也为用合成生物学方法生产复杂香豆素化合物以及用植物基因工程的方法调控白花前胡品质提供理论基础
。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了用于合成复杂香豆素的
CYP450
环化酶基因
PpDC
与
PpOC
及其应用
。
[0006]技术方案：为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种用于合成复杂香豆素的
CYP450
环化酶基因
PpDC
，所述
PpDC
的
CDS
区核苷酸序列如
SEQ ID NO:1
所示
。
[0008]本专利技术还提供了一种用于合成复杂香豆素的
CYP450
环化酶基因
PpOC
，所述
PpOC
的
CDS
区核苷酸序列如
SEQ ID NO:2
所示
。
[0009]本专利技术利用生物信息学技术对白花前胡全长转录组测序结果进行分析，挖掘到了
一条注释为7‑
去甲基软木花椒素环化酶的基因
PpDC
和一条注释为王草酚环化酶的基因
PpOC
，分别为其设计一对用于
PCR
扩增的特异性引物：
PpDC
‑
F:5
’‑
CTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGTCTCTAGTTGATTTTGTCCC
‑3’
[0010]PpDC
‑
R:5
’‑
TGATGGATATCTGCAGAATTCTTAGCGAATCTTCGGTATGGCTTC
‑3’
；和
PpOC
‑
F:5
’‑
CTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGTCTCCCATTGCTTTGGC
‑3’
[0011]PpOC
‑
R
：5’‑
TGATGGATATCTGCAGAATTCTTAAATTTGACGAATCTTCGGTATG
‑3’
；
[0012]对白花前胡根和叶片样品
cDNA
进行
PCR
扩增，获得了催化白花前胡中7‑
去甲基软木花椒素环化的功能基因的
CDS
序列
(
全长为
1494bp)、
催化王草酚环化的功能基因的
CDS
序列
(
全长为
1515bp)
，
PpDC
基因的
CDS
序列具体如
SEQ ID NO:1
所示的核苷酸序列，
PpOC
基因的
CDS
序列具体如
SEQ ID NO:2
所示的核苷酸序列
。
[0013]第二方面，本专利技术提供了所述的
CYP450
环化酶基因
PpDC
编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如
SEQ ID NO:3
所示，或经替换
、
缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列
。
[0014]本专利技术还提供了所述的
CYP450
环化酶基因
PpOC
编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如
SEQ ID NO:4
所示，或经替换
、
缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列
。
[0015]第三方面，本专利技术提供了一种重组表达载体，其含有所述的
CYP450
环化酶基因
PpDC
，或者含有所述的
CYP450
环化酶基因
PpOC。
[0016]优选的，所述重组表达载体为
pYES2.0。
具体的，所述重组表达载体为
pYES2
‑
PpDC
或
pYES2
‑
PpOC。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于合成复杂香豆素的
CYP450
环化酶基因
PpDC
，其特征在于，所述
PpDC
的
CDS
区核苷酸序列如
SEQ ID NO:1
所示
。2.
一种用于合成复杂香豆素的
CYP450
环化酶基因
PpOC
，其特征在于，所述
PpOC
的
CDS
区核苷酸序列如
SEQ ID NO:2
所示
。3.
权利要求1所述的
CYP450
环化酶基因
PpDC
编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如
SEQ ID NO:3
所示，或经替换
、
缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列
。4.
权利要求2所述的
CYP450
环化酶基因
PpOC
编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如
SEQ ID NO:4
所示，或经替换
、
缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列
。5.
一种重组表达载体，含有权利要求1所述的
CYP450
环化酶基因
PpDC
，或者含有权利要求2所述的
CYP450
环化酶基因
PpOC。6.
一种重组表达工程菌，含有权利要求1所述的
CYP450
环化酶基因
PpDC
，或者含有权利要求2所述的
CYP4...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵玉成，唐欢迎，赵鑫锐，秦民坚，谢国勇，朱艳，洪雅琪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：