一种D-转氨酶突变体及在制备L-草铵膦中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种D

【技术实现步骤摘要】
一种D
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转氨酶突变体及在制备L
‑
草铵膦中的应用
(一)

[0001]本专利技术涉及生物工业领域，特别是涉及一种D
‑
转氨酶突变体及以外消旋D,L
‑
草铵膦为底物，利用生物多酶级联一锅法制备L
‑
草铵膦的方法。
(二)
技术介绍

[0002]草铵膦，又称草丁膦，英文名为Phsophinothricin(简称PPT)，化学名为2
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氨基
‑4‑
[羟基(甲基)膦酰基]‑
丁酸，是一种高效、广谱、低毒的非选择性除草剂，是目前转基因抗性作物理想的除草剂，应用前景非常广阔。草铵膦有两种对映异构体，但只有L
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构型具有植物毒性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性小，对环境的破坏力小。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L
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构型的光学纯异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。
[0003]光学纯L
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草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。
[0004]手性拆分法是通过对外消旋D,L
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草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而得到光学纯的L
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草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂，成本昂贵。
[0005]化学合成法是从手性原料出发合成光学纯L
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草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备L
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草铵膦。
[0006]生物催化法生产L
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草铵膦则具有严格的立体选择性、反应条件温和、收率高等优点，是生产L
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草铵膦的优势方法。主要包括以下两类：
[0007](1)以L
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草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体。
[0008](2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但是理论收率只能达到50％，造成原料浪费。
[0009]除了这两种传统的生物催化法，以D,L
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草铵膦为原料的去消旋合成方法凸显了巨大的成本优势。由于市售的草铵膦为D,L
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草铵膦，其工业化生产技术已十分成熟，去消旋合成方法直接以D,L
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草铵膦为原料，简单易得，成本较低，能够较好符合现有L
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草铵膦工业生产体系。
[0010]转氨酶(transaminase，EC 2.6.1.X)是典型的5'
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磷酸吡哆醛(PLP)依赖酶，介导氨基供体与氨基受体之间的氨基转移反应，具有高对映选择性，广底物谱和高催化活力，在手性氨基酸和手性胺的合成中具有广泛的应用。转氨酶催化α
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酮酸与α
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氨基酸之间的氨基转移反应属于可逆反应，且具有较低的反应平衡常数(Keq＝1)，往往受到产物或副产物的抑制，导致无法达到理论100％的转化率。转氨酶根据PLP的折叠类型分为PLP折叠类型I和PLP折叠类型IV，其中D
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转氨酶属于PLP折叠类型IV，具有独特的对映选择性，可催化D
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氨基酸和酮酸之间的可逆转化。
(三)
技术实现思路

[0011]本申请提供了一种D
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转氨酶突变体及在一锅法拆分外消旋D,L
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草铵膦制备L
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草铵膦中的应用，以外消旋D,L
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草铵膦为底物，利用生物多酶级联一锅法制备L
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草铵膦的，将无除草活力的D
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草铵膦转化为具有除草活力的L
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草铵膦。所述酶催化体系包括用于将D,L
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草铵膦中的D
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草铵膦催化为2
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羰基
‑4‑
[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的D
‑
转氨酶突变体、以及用于将2
‑
羰基
‑4‑
[羟基(甲基)膦酰基]丁酸催化还原为L
‑
草铵膦的谷氨酸脱氢酶。该方法具有催化底物浓度高，副产物少，转化率与产率高，较大的工业化应用潜力的优点。
[0012]本专利技术采用的技术方案是：
[0013]本专利技术提供一种D
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转氨酶突变体，所述D
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转氨酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第265位色氨酸突变为丝氨酸(W265S)；所述D
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转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0014]本专利技术还提供一种所述D
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转氨酶突变体的编码基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
[0015]本专利技术还涉及一种含所述D
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转氨酶突变体的编码基因的重组载体以及由所述重组载体构建的重组基因工程菌。所述重组载体可以利用本领域任何表达质粒作为表达载体，如pET
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24a(+)，pET
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28b(+)，pET
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Duet1，pCDF
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Duet1，pACYC
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Duet1，pRSF
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Duet1等，利用优选pET
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28a(+)质粒具有更高的表达效率。所述重组基因工程菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。表达质粒的构建可通过一步无缝克隆，双酶切，单酶切等本领域任何方法，构建好的质粒可以通过转化导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
[0016]本专利技术还提供一种所述D
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转氨酶突变体在一锅法拆分外消旋D,L
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草铵膦制备L
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草铵膦中的应用，所述应用的方法为：以含D
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转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋D,L
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草铵膦为底物，以氨基供体和D
‑
葡萄糖为辅底物，以氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶为辅酶，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)为氧化还原辅因子，加入氨基受体和磷酸吡哆醛，以pH6.5
‑
8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25
‑
50℃反应8
‑
24h，将反应液分离纯化，获得L
‑
草铵膦；所述氨基受体为丙酮酸，α
‑
酮戊二酸，α
‑
酮丁二酸或3
‑
丁酮酸，优选为丙酮酸；所述氨基供体为硫酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种D
‑
转氨酶突变体，其特征在于，所述D
‑
转氨酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第265位色氨酸突变为丝氨酸。2.一种权利要求1所述D
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转氨酶突变体的编码基因。3.一种含权利要求1所述D
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转氨酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。4.一种权利要求1所述D
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转氨酶突变体在一锅法拆分外消旋D,L
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草铵膦制备L
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草铵膦中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：以含D
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转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋D,L
‑
草铵膦为底物，以氨基供体和D
‑
葡萄糖为辅底物，以氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶为辅酶，以NADH为氧化还原辅因子，加入氨基受体和磷酸吡哆醛，以pH6.5
‑
8.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25
‑
50℃反应8
‑
24h，将反应液分离纯化，获得L
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草铵膦；所述氨基受体为丙酮酸，α
‑
酮戊二酸，α
‑
酮丁二酸或3
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丁酮酸；所述氨基供体为硫酸铵或甲酸铵。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，所述催化剂加入终浓度以湿菌体重量计为5
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50g/L；底物加入终浓度为40
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400mM；所述D
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葡萄糖加入终浓度为30
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300mM；所述氨基受体加入终浓度为20
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800mM；所述NADH加入终浓度为0.05
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1.0mM；所...

【专利技术属性】
技术研发人员：金利群，段咪咪，刘汉林，吴佳敏，薛亚平，柳志强，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：