一种双顺反子翻译偶联表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双顺反子翻译偶联表达载体，所述表达载体在pET

【技术实现步骤摘要】
一种双顺反子翻译偶联表达载体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程生物
，具体涉及的是一种分子伴侣与贻贝蛋白构建成双顺反子翻译偶联表达载体并用其进行协同表达提高可溶性表达水平的方法。

技术介绍

[0002]海洋贻贝在各沿海国家均有分布，其足端能够分泌足丝，使贻贝能够在高强度的冲击下和潮湿水环境中仍然牢固地附着在物体表面。在足丝中发挥主要粘附作用的被认为是贻贝足蛋白(Mussel foot proteins，Mfps)。贻贝足蛋白强大的粘附力使贻贝在水中具有持久的粘附强度，以及在几乎所有类型的有机和无机材料上同时保持柔韧性和弹性。贻贝蛋白优异的性能使其在蛋白质组成、粘附机制的推测以及仿贻贝足蛋白粘附材料方面受到了很多关注。
[0003]为了进一步研究贻贝蛋白，必须获取一定量的蛋白。采用直接提取的办法，提取1g贻贝足蛋白(Mfp
‑
1和Mfp
‑
2混合物)需要数万个贻贝，高昂的成本限制了贻贝的研究。采用基因工程法使贻贝蛋白进行异源表达是现在研究的热门方向。Mfp
‑
1是第一个被鉴定的蛋白，尝试对其重组生产。Mfp
‑
1部分十肽重复序列(6
‑
20)在大肠杆菌中高效表达，6个十肽重复以包涵体形式表达，20个十肽重复以可溶和不可溶形式表达。Mfp
‑
3富含Dopa，为关键粘附蛋白，拥有30
‑
35种不同的变体。来源于M.galloprovincialis的Mgfp
‑/>3A和Mgfp
‑
5的cDNA序列先后被鉴定，根据大肠杆菌的密码子使用偏好对密码子进行优化后，重组Mgfp
‑
3A的产量从0.8mg/L提高到47mg/L(一半表达为包涵体)；Mgfp
‑
5的产量从2.6mg/L提高到50mg/L。本课题组在之前的研究中实现了M.galloprovincialis中的另一种变体3B(Mgfp
‑
3B)在大肠杆菌中的重组表达，简单的纯化步骤后产量为～51mg/L。但Mgfp
‑
3B与Mgfp
‑
3A表达相似，仍有一半的蛋白为包涵体蛋白。
[0004]大肠杆菌是基因工程领域被最常用的宿主，培养简单，菌体生产快，容易操作，因此被广泛应用于表达重组异源蛋白。但是使用重组DNA技术在大肠杆菌表达目的蛋白时，由于缺少用于蛋白折叠的关键元件，导致折叠效率较低，重组蛋白容易聚集生成没有生物活性的包涵体，需要经过复杂的变性复性过程才能使蛋白重新折叠变成功能蛋白。同时异源表达生产目的蛋白的表达量也很低。目前已经有较多方法来解决包涵体表达的问题。与标签蛋白融合表达，与分子伴侣共表达，更换启动子或者RBS序列，降低表达温度等均被尝试用来解决上述问题。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种双顺反子翻译偶联表达载体，进一步提出了一种共表达贻贝蛋白Mgfp
‑
3B与分子伴侣SUMO和/或TrxA的基因工程菌的构建方法。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题在于提供一种促进贻贝蛋白Mgfp
‑
3B可溶性表达的发酵培养基和发酵工艺。
[0007]综上所述，本研究旨在探寻一种高效表达可溶性贻贝蛋白的方法。在大肠杆菌中
共表达分子伴侣可以协助外源基因的表达，在贻贝蛋白的研究中还未有利用分子伴侣提高可溶性表达的方法。
[0008]本专利技术中，M.galloprovincialis中的Mfp
‑
3变体B(Mgfp
‑
3B)在E.coli中重组表达,分子量仅有12Kda。通过基因工程手段，将分子伴侣SUMO和/或TrxA基因与贻贝蛋白Mgfp
‑
3B在表达载体pET
‑
28a(+)上构建成双顺反子翻译偶联表达载体并转入E.coli BL21(DE3)中进行表达，实现了60
‑
70％目的蛋白以可溶性形式；表达通过不断优化发酵培养基和发酵条件，可溶性贻贝蛋白产量可达200
‑
300mg/L。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种双顺反子翻译偶联表达载体，所述表达载体在pET
‑
28a(+)质粒上插入分子伴侣、新的核糖体结合位点和目的蛋白基因，构建成双顺反子翻译偶联表达载体，其中，分子伴侣基因位于插入的新的核糖体结合位点上游，贻贝蛋白基因位于插入的新的核糖体结合位点下游，所述分子伴侣为SMUO和TrxA中的任意一种或两种的组合。
[0010]在一个具体的实施方式中，所述目的蛋白基因为贻贝蛋白Mgfp
‑
3B，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
[0011]本专利技术进一步提出了上述的双顺反子翻译偶联表达载体的构建方法，包括如下步骤：
[0012](1)对贻贝蛋白Mgfp
‑
3B、分子伴侣SUMO、TrxA和SUMO
‑
TrxA基因编码区的克隆，其中在分子伴侣的下游引物和贻贝蛋白的上游引物均引入一个额外的核糖体结合位点；当贻贝蛋白与分子伴侣片段连接时，新引入的核糖体结合位点充当连接肽避免两者直接融合表达，同时双顺反子结构也避免了融合表达而带来的下游分子伴侣酶切操作，其中，新引入的核糖体结合位点独立于原质粒中的核糖体结合位点且与原质粒中的核糖体结合位点序列不同。
[0013](2)贻贝蛋白Mgfp
‑
3B分别与分子伴侣SUMO、TrxA和SUMO
‑
TrxA进行连接并转入质粒pET
‑
28a(+)中构建成表达载体pET
‑
28a(+)
‑
SUMO
‑
Mgfp
‑
3B、pET
‑
28a(+)
‑
TrxA
‑
Mgfp
‑
3B和pET
‑
28a(+)
‑
SUMO
‑
TrxA
‑
Mgfp
‑
3B。
[0014]其中，所述编码基因SUMO的核苷酸序列如序列表3所示，其氨基酸序列如序列表4所示；所述编码基因TrxA的核苷酸序列如序列表5所示，其氨基酸序列如序列表6所示。
[0015]本专利技术进一步提出了一种重组基因工程菌株，所述重组基因工程菌株通过将上述双顺反子翻译偶联表达载体转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中得到。
[0016]本专利技术进一步提出了上述双顺反子翻译偶联表达载体或重组基因工程菌株在制备可溶性贻贝蛋白上的应用。
[0017]具体地，本专利技术提出了一种可溶性贻贝蛋白的制备方法，该方法为摇瓶发酵制备贻贝蛋白的方法，具体包括如下步骤：
[0018](1)将所述重组基因工程菌株经平板本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双顺反子翻译偶联表达载体，其特征在于，所述表达载体在pET
‑
28a(+)质粒上插入分子伴侣、新的核糖体结合位点和目的蛋白基因，构建成双顺反子翻译偶联表达载体，其中，分子伴侣基因位于插入的新的核糖体结合位点上游，贻贝蛋白基因位于插入的新的核糖体结合位点下游，所述目的蛋白基因为贻贝蛋白基因，所述分子伴侣为SMUO和TrxA中的任意一种或两种的组合。2.根据权利要求1所述的双顺反子翻译偶联表达载体，其特征在于，所述贻贝蛋白基因为Mgfp
‑
3B，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。3.权利要求1或2所述的双顺反子翻译偶联表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）对贻贝蛋白基因、分子伴侣SUMO、TrxA和SUMO
‑
TrxA基因编码区的克隆，其中在分子伴侣的下游引物和贻贝蛋白的上游引物均引入一个额外的核糖体结合位点；（2）贻贝蛋白Mgfp
‑
3B分别与分子伴侣SUMO、TrxA和SUMO
‑
TrxA进行连接并转入质粒pET
‑
28a(+)中构建成表达载体pET
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28a(+)
‑
SUMO
‑
Mgfp
‑
3B、pET
‑
28a(+)
‑
TrxA
‑
Mgfp
‑
3B和pET
‑
28a(+)
‑
SUMO
‑
TrxA
‑
Mgfp
‑
3B。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述编码基因SUMO的核苷酸序列如序列表3所示，其氨基酸序列如序列表4所示；所述编码基因TrxA的核苷酸序列如序列表5所示，其氨基酸序列如序列表6所示。5.一种重组基因工程菌株，其特征在于，所述重组基因工程菌株通过将权利要求1所述的双顺反子翻译偶联表达载体转入表达宿主E. coli BL21(DE3)中得到。6.权利要求1所述的双顺反子翻译偶联表达载体或权利要求5所述的重组基因工程菌株在制备可溶性贻贝蛋白上的应用。7.一种可溶性贻贝蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将权利要求5所述的重组基因工程菌株经平板活化后接种至装有液体培养基的摇瓶中，35
‑
40℃，180
‑
220rpm培养8
‑
12h用作种子液；（2）将步骤（1）中的种子液按1
‑
10%的接种量接种至装有液体培养基的挡板摇瓶中，35
‑
40℃，180
‑
220rpm培养，在OD
6...

【专利技术属性】
技术研发人员：李莎，王鑫沂，徐虹，王瑞，罗正山，邱益彬，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：