脂肪酶突变体及其在白酒黄水处理中的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种脂肪酶突变体及其在白酒黄水处理中的应用。本发明专利技术通过大量随机突变的筛选，得到一种耐酸性、耐醇性均显著提高的脂肪酶突变体。所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的脂肪酶的第78位氨基酸由Asn变为Arg，第187位氨基酸由Asn变为Arg。本发明专利技术构建得到高效表达该突变体的黑曲霉工程菌，为脂肪酶的广泛应用奠定基础。泛应用奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
脂肪酶突变体及其在白酒黄水处理中的应用


[0001]本专利技术属于功能基因改造与筛选
，具体涉及一种脂肪酶突变体及其在白酒黄水处理中的应用。

技术介绍

[0002]脂肪酶(E.C.3.1.1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油酰基水解酶，是一类可以水解甘油三酯产生不同链长游离脂肪酸和甘油的水解酶。它是生物体内一类重要的代谢酶，从催化特性看，它具有高度的化学选择性和立体异构性，且反应不需辅酶，反应条件温和，副产物少。
[0003]脂肪酶的一个显著特征是它不同于多数水解酶的催化特性，它是一类非水相酶，其催化反应是在油水界面上进行，对于水溶性底物不起催化作用。不同来源的脂肪酶作用于底物甘油三酯的酯键位置不同。
[0004]脂肪酶是一种具有双重酯催化作用的生物催化剂。首先，脂肪酶能够催化酯类水解，分解成醇类和脂肪酸类。其次，脂肪酶在特定的条件下，还能够催化醇类和脂肪酸类物质脱水缩合，生成酯类。同时，在特定的条件下，它还可以催化酯类物质同相应的酸类物质或者醇类物质发生转酯化反应，生成新的酯类物质。
[0005]在传统浓香型白酒生产过程中，入窖酒醅的含水量大多在52％～55％之间，经微生物分解代谢后产生大量的游离水，这些水将酒醅的酸、可溶性淀粉、还原糖、单宁、酒精及香味前体物质溶出，再与酒醅中未被微生物所利用的水一起沉降，最后慢慢沉积在窖池底部而形成棕褐色、呈流体状的液体，这种液体被称为之黄水。作为浓香型白酒酿造过程中的副产物之一，黄水又称黄浆水，含有醇类、酸类、醛类、酯类等呈香呈味物质，还含有经长期驯化的有益微生物、糖类物质、含氮化合物和少量的单宁及色素等有机物。白酒厂对黄水的主要利用途径是制作黄水酒来勾兑低档酒或者直接灌窖，存在利用效率低等问题。有的酒厂将其作为废水直接排放，造成了严重的环境污染。
[0006]许多厂家和专家通过生物酯化技术实现对黄水的资源化利用。在目前研究中，酯化制剂多是以菌酶复合物形式出现，其具有发酵周期较长(大于7d)，酶活低，增香效果不稳定等缺点。单酶制剂(脂肪酶)成功解决了酯化液发酵周期较长的问题，加速了酯化反应的进程，提高了酯化率。但脂肪酶的稳定性极大影响着其催化有机酸成酯的效率，是目前本领域的研究重点。

技术实现思路

[0007]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种脂肪酶突变体及其在白酒黄水处理中的应用。本专利技术通过大量随机突变的筛选，得到一种耐酸性、耐醇性均显著提高的脂肪酶突变体，并构建得到高效表达该突变体的黑曲霉工程菌，从而为脂肪酶的广泛应用奠定基础。
[0008]本专利技术一方面涉及一种脂肪酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的脂肪酶的第78位氨基酸由Asn变为Arg，第187位氨基酸由Asn变为Arg。
[0009]所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
[0010]本专利技术还涉及编码所述突变体的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
[0011]本专利技术还涉及携带有上述脂肪酶基因的重组表达载体。
[0012]本专利技术还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
[0013]所述宿主细胞为黑曲霉(Aspergillus niger)。
[0014]本专利技术还涉及所述脂肪酶突变体在白酒黄水处理中的应用。
[0015]与野生型相比，本专利技术提供的脂肪酶突变体对酸性环境和乙醇的耐受性显著增强。野生型脂肪酶的最适作用pH为7.0，而所述突变体的最适作用pH为4.5，且在pH 3.0
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5.0条件下的相对酶活仍高于90％，耐酸效果显著；当反应体系酒精浓度为30度时，所述突变体的相对酶活比野生型提高了约20％，取得了意料不到的技术效果。
[0016]所述脂肪酶突变体可高效催化白酒黄水中有机酸的酯化过程，总酯含量比野生型处理组提高了162％，乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯的含量分别达66.2mg/100mL、22.4mg/100mL、280.2mg/100mL，效果显著。
附图说明
[0017]图1为pH
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相对酶活变化曲线；
[0018]图2为温度
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相对酶活变化曲线；
[0019]图3为耐醇性变化曲线。
具体实施方式
[0020]下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0021]下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。
[0022]实施例1脂肪酶突变体的筛选
[0023]将来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶命名为ROL，其氨基酸序列为SEQ IDNO：1，基因序列为SEQ ID NO：2。在ROL基因的起始密码子ATG前增加9个碱基CTTAAGAGG，在其终止密码子TGA后增加AGGTCTAGA，然后将此序列交由上海生工生物工程股份有限公司根据黑曲霉密码子偏好性进行密码子优化，并由该公司进行合成。
[0024]用限制性内切酶AflII和XbaI(Fermentas)对脂肪酶基因进行酶切；同时，用限制性内切酶AflII和XbaI对质粒pGm进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化入Trans5a大肠杆菌(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。
[0025]使用质粒小量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒。获得1个重组质粒，命名为ROLT。
[0026]为了提高脂肪酶ROL的耐酸性，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物lip
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F、lip
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R如下：
[0027]lip
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F：AAACTTAAGATGCGGTCCTCCTGG(下划线处为AflII酶切位点)；
[0028]lip
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R：AGGTCTAGATCACAGACAGGTGCCG(下划线处为XbaI酶切位点)。
ROLT)。
[0040]通过上述同样的转化方法将野生型重组质粒ROL克隆到黑曲霉宿主G1中，30℃下培养7～10d；挑取其中一株阳性转化子命名为黑曲霉ROL(Aspergillus niger ROL)。
[0041]溶液A：2.5mL 1M K2HPO4，2.5mL 1M KH2PO4，48.156g MgSO4，加入ddH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
[0042]溶液B：5mL 1M Tris(pH 7.5)，2.77g CaCl2，109.32g山梨醇，加入ddH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。
[0043]溶液C：250g PE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶的第78位氨基酸由Asn变为Arg，第187位氨基酸由Asn变为Arg。2.如权利要求1所述的脂肪酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO:3。3.编码权利要求1所述脂肪酶突变体的基因。4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙海燕，徐晓东，曹体爽，单凯，唐波，刘晓慧，
申请(专利权)人：无锡蔚蓝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：