一种以芳香族羧酸或杂环羧酸为原料生物合成伯胺的方法技术

本发明专利技术公开一种以芳香族羧酸或杂环羧酸为原料生物合成伯胺的方法，生物工程技术领域。提供一种生物合成芳香族或杂环族伯胺的方法。本发明专利技术提供一种以芳香族羧酸或杂环羧酸为底物，以基因工程菌为生物催化剂；所述基因工程菌被敲除DNA结合转录双调节因子arcA，并过表达羧酸还原酶基因nccar、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因pptase和ω

【技术实现步骤摘要】
一种以芳香族羧酸或杂环羧酸为原料生物合成伯胺的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种以芳香族羧酸或杂环羧酸为原料生物合成伯胺的方法。

技术介绍

[0002]芳香族或杂环族伯胺，应用广泛，如4
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氟苄胺是镇痛药“氟吡汀”的中间体。糠胺可制成强利尿剂“呋塞米”，利尿作用强。2,4
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二氟苄胺是葛兰素史克(GSK)旗下新型抗HIV药物“度鲁特韦”的关键中间体。肉桂胺可用于合成抗真菌剂“萘替芬”，用于治疗癣、毛癣菌和表皮癣菌的感染。目前合成芳香族或杂环族伯胺的方法几乎都是化学合成法，如苄胺的合成主要以苯甲腈、苯甲醛为原料。例如，在水/乙醇混合物中，以次磷酸钙和镍络合物做催化剂，催化苯甲腈以生成苄胺；在80℃，2.5bar H2下，以负载含氮中孔碳(MC)的镍纳米颗粒(缩写为MC/Ni)为催化剂，催化苯甲腈的氢化或苯甲醛还原胺化来合成苄胺。但是化学合成法存在多种弊端，如镍等金属对环境污染严重，底物苯甲腈具有高毒性，还有需要高温、加氢条件等使得成本较高，这导致产品质量跟不上应用行业的发展。以微生物发酵法生产芳香族或杂环族伯胺具有绿色、安全、低成本等优势，已成为芳香族或杂环族伯胺的发展趋势。然而关于芳香族或杂环族伯胺生物合成文献报导较少。例如，Yi Zhou等人曾以可再生原料为底物，在代谢工程化改造的大肠杆菌中构建九步人工酶的级联反应实现苄胺的生成，但该方法并不适用于其他芳香族或杂环族伯胺。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是为了提供一种生物合成芳香族或杂环族伯胺的方法。
[0004]本专利技术提供了一种以芳香族羧酸或杂环羧酸为原料生物合成伯胺的方法，以芳香族羧酸或杂环羧酸为底物，以基因工程菌为生物催化剂进行发酵反应；所述基因工程菌被敲除DNA结合转录双调节因子arcA，并过表达羧酸还原酶基因nccar、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因pptase和ω
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转氨酶基因oata。
[0005]进一步地限定，反应的条件为温度30℃，pH7.0，时间至少2小时。
[0006]进一步地限定，基因工程菌：底物量之比OD600nm＝10
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150：5
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60mM。
[0007]进一步地限定，催化反应体系中添加MgSO4、L
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丙氨酸、芳香族羧酸或杂环羧酸和缓冲液。
[0008]进一步地限定，所述芳香族羧酸或杂环羧酸为2
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吡啶羧酸、糠酸、4
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氟苯甲酸、2,4
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二氟苯甲酸和2,4
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二甲氧基苯甲酸其中任意一个或多个。
[0009]进一步地限定，所述基因工程菌的出发菌为大肠杆菌K
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12MG1655 RARE，即敲除了3个醛酮还原酶基因和3个醇脱氢酶基因的大肠杆菌K
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12MG1655。
[0010]进一步地限定，所述醛酮还原酶基因为dkgB基因、yeaE基因和dkgA基因；所述醇脱氢酶基因为yqhD基因、yahK基因和yjgB基因。
[0011]进一步地限定，所述DNA结合转录双调节因子arcA的GeneBank ID为QJZ27444.1；
所述羧酸还原酶基因nccar的GeneBank ID为XM_950727.2、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因pptase的GeneBank ID为CP024090.1和ω
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转氨酶基因oata基因的GeneBank ID为CP000758.1。
[0012]本专利技术提供上述的方法在制备芳香伯胺或杂环伯胺中的领域的应用。
[0013]有益效果：构建了芳香族或杂环族伯胺在大肠杆菌中的生物合成途径，使芳香族或杂环族伯胺的生成更温和，而且无环境污染，除了2,4
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二甲氧基苄胺，该全细胞催化体系生产其他4种伯胺的产率可达90％左右，证明该合成途径具有通用性。这为其他芳香类或杂环类伯胺的生物合成提供了新思路。
附图说明
[0014]图1为pET28a
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nccar
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pptase重组质粒结构示意图；
[0015]图2为pACYCDuet1
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oata重组质粒结构示意图；
[0016]图3为凝胶电泳检测结果，其中，M：Marker，1
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2：阴性对照RARE，3
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4：阳性对照JW4364，5
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19：挑取单菌落进行PCR验证，目的条带约为1000bp。
[0017]图4为5mM的2，4
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二氟苄胺标品GC
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MS检测结果，其中，图A是气相gc，横坐标是出峰时间，纵坐标是响应强度；图B是质谱ms，横坐标是离子碎片，纵坐标是响应强度；出峰时间min，横坐标是m/z；
[0018]图5为2小时出峰时间的2，4
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二氟苄胺样品的GC
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MS检测结果，GC
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MS检测结果，其中，图A是气相gc，横坐标是出峰时间，纵坐标是响应强度；图B是质谱ms，横坐标是离子碎片，纵坐标是响应强度；出峰时间min，横坐标是m/z；
[0019]图6为5mM 4
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氟苄胺标品的GC
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MS检测结果，GC
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MS检测结果，其中，图A是气相gc，横坐标是出峰时间，纵坐标是响应强度；图B是质谱ms，横坐标是离子碎片，纵坐标是响应强度；出峰时间min，横坐标是m/z；
[0020]图7为2小时出峰时间的4
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氟苄胺样品GC
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MS检测结果，GC
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MS检测结果，其中，图A是气相gc，横坐标是出峰时间，纵坐标是响应强度；图B是质谱ms，横坐标是离子碎片，纵坐标是响应强度；出峰时间min，横坐标是m/z；
[0021]图8为2，4
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二甲氧基苄胺标品的GC
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MS检测结果，GC
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MS检测结果，其中，图A是气相gc，横坐标是出峰时间，纵坐标是响应强度；图B是质谱ms，横坐标是离子碎片，纵坐标是响应强度；出峰时间min，横坐标是m/z；
[0022]图9为2小时出峰时间的2，4
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二甲氧基苄胺样品的GC
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MS检测结果，GC
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MS检测结果，其中，图A是气相gc，横坐标是出峰时间，纵坐标是响应强度；图B是质谱ms，横坐标是离子碎片，纵坐标是响应强度；出峰时间min，横坐标是m/z；
[0023]图10为5mM的糠胺标品的GC
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MS检测结果，GC
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MS检测结果，其中，图A是气相gc，横坐标是出峰时间，纵坐标是响应强度；图B是质谱ms，横坐标是离子碎片，纵坐标是响应强度；出峰时间min，横坐标是m/z；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以芳香族羧酸或杂环羧酸为原料生物合成伯胺的方法，其特征在于，以芳香族羧酸或杂环羧酸为底物，以基因工程菌为生物催化剂进行发酵反应；所述基因工程菌被敲除DNA结合转录双调节因子arcA，并过表达羧酸还原酶基因nccar、磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因pptase和ω
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转氨酶基因oata。2.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，反应的条件为温度30℃，pH＝7.0，时间至少2小时。3.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，基因工程菌：底物量之比OD
600nm
＝10
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150：5
‑
60mM。4.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述芳香族羧酸或杂环羧酸为2
‑
吡啶羧酸、糠酸、4
‑
氟苯甲酸、2,4
‑
二氟苯甲酸和2,4
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二甲氧基苯甲酸其中任意一个或多个。5.根据权利要求1所述的的方法，其特征在于，催化反应体系中添加MgSO4、L
‑
丙氨酸、芳香族羧酸或杂环羧酸和缓冲液。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述芳香族羧酸或杂环羧酸为2
‑
吡啶羧酸、糠酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘炜，冯埃生，
申请(专利权)人：广东腐蚀科学与技术创新研究院，
类型：发明
国别省市：