靶向ROR2的亲和力成熟和人源化结合结构域制造技术

本发明专利技术涉及抗体及其衍生物，例如双特异性抗体和嵌合抗原受体(CAR)，其具有针对ROR2抗原的亲和力成熟和/或人源化靶向结构域。本发明专利技术包括编码所述抗体及其衍生物的核酸和载体，含其的细胞和药物组合物，特别是其在癌症治疗中的用途。中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向ROR2的亲和力成熟和人源化结合结构域


[0001]本专利技术涉及抗体及其衍生物，例如双特异性抗体和嵌合抗原受体(CAR)，其亲和力成熟和/或人源化的靶向结构域对ROR2抗原有特异性。本专利技术包括编码所述抗体及其衍生物的核酸和载体，含有其的细胞和药物组合物，特别是其在癌症治疗中的用途。

技术介绍

[0002]CAR
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T细胞
[0003]表达肿瘤相关抗原特异性T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传修饰T细胞的过继转移是一种有效的癌症治疗方法[1
‑
5]。CAR是合成受体，通常通过将肿瘤细胞表面分子特异性单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFV)连接到跨膜结构域、一个或多个细胞内共刺激信号模块和CD3ζ来构建[6
‑
8]。CAR修饰的T细胞赋予了对肿瘤细胞的非MHC限制性识别，并且已经报道了对B细胞恶性肿瘤患者在接受了用B细胞系限制性CD19分子特异性的CAR修饰的自体T细胞治疗后的持久反应。这些患者的主要毒性与肿瘤溶解、细胞因子释放和正常B淋巴细胞的长期耗竭有关[1
‑
3，5，9]。
[0004]ROR2作为癌症治疗的新靶点：
[0005]单克隆抗体(mAb)广泛应用于癌症免疫治疗，约有30种基于抗体的癌症疗法获得FDA批准并上市[10]。新的合适的癌症抗原的罕见鉴定限制了适应单克隆抗体治疗的适应症和患者。由于体酪氨酸激酶(RTKs)在癌细胞上的过量表达，已证明其作为癌抗原具有普遍适用性。
[0006]一个尚未被FDA批准的单克隆抗体靶向的RTK是ROR2(受体酪氨酸激酶样孤儿受体2)，它在胚胎发生期间表达，并在出生后的组织中严格下调[11
‑
13]。许多实体和血液恶性肿瘤已显示表达ROR2，表明其适合作为基于抗体的癌症治疗的靶点[14]。
[0007]最近，本专利技术人已经提出ROR2作为癌症免疫疗法的候选。ROR2在胚胎发育期间表达，并对神经和骨骼发育起重要作用。已经证明，当其与配体WNT5A结合时，其参与WNT信号通路，并在胚胎发育期间促进细胞极化，同时调节迁移和分化[15
‑
18]。
[0008]ROR2在小鼠[19]和人[20，21]出生后大幅下调，而在几种癌症中过表达[14，15]，包括实体恶性肿瘤如肾细胞腺癌和乳腺癌的亚群，以及血液恶性肿瘤如多发性骨髓瘤[22
‑
25]。在未被FDA批准和上市的基于抗体的癌症治疗的实体恶性肿瘤中，一个值得注意的适应症是肉瘤，其中在骨肉瘤、平滑肌肉瘤和胃肠道间质瘤(GIST)中发现ROR2过表达[21，26]。大量研究表明，ROR2表达与快速的疾病发展、肿瘤侵袭和转移相关，使ROR2成为有前景的癌症靶点和生物标志物[24，27，28]。
[0009]最近，ROR2靶向运动从临床前研究转化为临床研究(NCT03504488，NCT03393936，NCT03960060)，这突出了ROR2作为基于抗体的癌症治疗的候选抗原的适用性和吸引力。
[0010]然而，本领域仍然需要更有效的癌症疗法和可用于这种疗法的更有效的治疗剂。

技术实现思路

[0011]本专利技术尤其涉及已知抗ROR2抗体XBR2
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401的亲和力成熟和人源化结合结构域及其在构建双特异性抗体(bi
‑
mAb)和抗体衍生物如CAR和CAR工程T细胞的用途。例如，如参考文献[29，30]对于XBR2
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401抗体的描述，出于所有目的通过引用将其全部内容并入本文。与亲本兔XBR2
‑
401结合结构域相比，本专利技术中的bi
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mAb和CAR具有更高的结合亲和力和/或“人(human
‑
ness)”的程度。根据本专利技术，在临床用于患者时，与兔(XBR2
‑
401)结合结构域相比，可预期到这些双特异性抗体、CAR和CAR工程T细胞表现出更高的功效和/或更低的免疫原性。
[0012]靶向人ROR2的环状(kringle)结构域(ROR2
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Kr)的新的亲和力成熟的人源化单克隆抗体(mAb)是基于与ROR2
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Kr复合的scFv格式(format)的XBR2
‑
401的未公开的共晶体结构，从现有技术的兔mAb XBR2
‑
401开发出来的[29，30]。该共晶体结构提供了副表位(抗体的抗原结合位点)和表位(抗原的抗体结合位点)相互作用的高分辨率的分子图像。令人惊讶的是，副表位/表位界面的分子图像揭示了重链第三互补决定区(HCDR3)与表位相互作用中的开放式空腔。专利技术人推断，这一缺口可以通过在HCDR3序列的一小段中添加和替换氨基酸残基来填补。他们提出，这样做可以提高亲和力并保持XBR2
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401的特异性。因此，对XBR2
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401的HCDR3中的短序列的氨基酸残基进行了随机化，包括长度变化，即包括零个、一个和两个额外的随机化位点。随后通过噬菌体展示技术选择与人ROR2结合的文库。这种组合的合理设计和体外进化策略产生了一组新的mAb，其HCDR3序列在氨基酸序列组成和长度方面都偏离mAb XBR2
‑
401。随后分别通过表面等离子体共振和细胞微阵列技术进行的分析证实了在不损失特异性的情况下亲和力的预期增加。其中一种新的命名为XBR2
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401
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X3.12的mAb，通过合理的设计进行了人源化，产生了XBR2
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401
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hX3.12.5和XBR2
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401
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hX3.12.6。后者再次与ROR2
‑
Kr共结晶，并通过封闭开放式空腔揭示了副表位和表位之间预期的更紧密的相互作用。总的来说，本专利技术人的令人惊讶的发现，其导致了本专利技术中要求保护的新mAb，是基于获取和分析大量的技术中没有的新数据(XBR2
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401与ROR2
‑
Kr复合物的X射线晶体结构)。本专利技术教导的基本原理，例如通过XBR2
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401
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hX3.12.6与ROR2
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Kr复合物的X射线晶体结构证实了填充副表位
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表位相互作用中特定的开放式空腔。
[0013]根据本专利技术，亲和力成熟可以通过本领域已知的任何方法进行。作为非限制性实例，XBR2
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401的VH和VL结构域的亲和力成熟已经通过确定的互补决定区区域的随机诱变进行。
[0014]根据本专利技术，人源化可通过本领域已知的任何方法进行。作为非限制性实例，X3.12单克隆抗体的VH和VL结构域的人源化已经通过CDR移植和利用ELISA、流式细胞术和表面等离子体共振来筛选针对ROR2靶标的最佳结合物。
[0015]根据本专利技术，可产生表达C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种能够结合人ROR2的抗体或其能够结合人ROR2的衍生物，其中所述抗体或其衍生物包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其特征在于，所述重链可变结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列具有选自由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组的氨基酸序列，并且其中所述CDR3序列不具有如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述重链可变结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列具有选自由SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组的氨基酸序列。3.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述重链可变结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列具有如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。4.如权利要求1或2所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述重链可变结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列具有选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38组成的组的氨基酸序列。5.如权利要求1或2所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述重链可变结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列具有选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35组成的组的氨基酸序列。6.如权利要求4所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述重链可变结构域包含CDR3序列，所述CDR3序列具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。7.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其衍生物，其中所述轻链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的CDR3序列或与如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列相差不超过两个氨基酸残基的CDR3序列。8.如权利要求7所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述轻链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的CDR3序列或与如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列相差不超过一个氨基酸残基的CDR3序列。9.如权利要求7所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述轻链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列的CDR3序列。10.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述重链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的CDR2序列，或与如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列相差不超过两个氨基酸残基的CDR2序列。11.如权利要求10所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述重链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的CDR2序列或与如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列相差不超过一个氨基酸残基的CDR2序列。12.如权利要求10所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述重链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列的CDR2序列。13.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述轻链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的CDR1序列，或与如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列相差不超过两个氨基酸残基的CDR1序列。14.如权利要求13所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述轻链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的CDR1序列或与如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列相
差不超过一个氨基酸残基的CDR1序列。15.如权利要求13所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述轻链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的CDR1序列。16.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述轻链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的CDR2序列，或与如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列相差不超过两个氨基酸残基的CDR2序列。17.如权利要求16所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述轻链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的CDR2序列或与如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列相差不超过一个氨基酸残基的CDR2序列。18.如权利要求16所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述轻链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列的CDR2序列。19.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述重链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的CDR1序列，或与如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列相差不超过两个氨基酸残基的CDR1序列。20.如权利要求19所述的抗体或其衍生物，其特征在于，所述重链可变结构域包含具有如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列的CDR1序列或与如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：尤利乌斯，
类型：发明
国别省市：