一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒及应用及应用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒及应用及应用方法。本发明专利技术通过高通量转录组测序，与疾病转归(死亡、存活)的相关性进行了分析，并通过qPCR验证。结果发现VSIG4在肝衰竭转归不良(死亡)患者中呈特异性高表达，与肝衰竭疾病转归(死亡、存活)有很好的相关性，稳定可靠。本发明专利技术公开的试剂盒检测过程简单、易于重复，具备专业资格的技术人员均可以完成，可行性强，能够提供准确的肝衰竭疾病转归预警预测结果，及时反映肝衰竭患者的疾病状态，可实现肝衰竭患者疾病转归预警预测，并指导医生对其制定针对性治疗方案，实现早期治疗，降低短期病死率。降低短期病死率。降低短期病死率。

【技术实现步骤摘要】
一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒及应用及应用方法


[0001]本专利技术涉及临床医学、生物医学和医学检验
，具体地说，是一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒及应用及应用方法。

技术介绍

[0002]肝功能衰竭疾病是一种受到多种因素(如病毒、酒精、药物等)引起肝细胞大量坏死，导致肝功能发生严重障碍或失代偿，进而出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要临床表现的复杂综合征。由于缺乏有效的治疗措施，其内科综合治疗的短期病死率高达50
‑
90％。目前临床上诊断肝衰竭和判断疾病转归的方法是综合各类肝衰竭的特点并结合生化指标，如检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素等判断肝功能损害程度及肝脏合并储备能力，检测凝血国际标准化比值、凝血酶原活动度等判断凝血功能。肝衰竭的预后取决于肝细胞坏死程度和再生能力之间的“较量”，如肝细胞大量再生超过坏死，则疾病逐渐恢复，反之，则病情恶化，预后较差。但由于肝衰竭诱因、病因、临床类型、病程、并发症及临床干预措施等的多样性及个体化差异，目前尚无统一的评估预后的指标。因此，寻找肝衰竭疾病转归预警预测的检测标志物，可实现早期治疗，降低肝衰竭短期高病死率具有重要的意义。
[0003]随着生物技术和分子医学的发展，应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出疾病诊断和预后预测的技术在临床上已得到广泛应用，如检测与疾病相关的各类结构蛋白、酶、抗原抗体、免疫活性分子基因等，实现对患者的早期诊断与疾病转归预警预测，提高治疗效果。目前分子诊断主要集中在检测特异性、相对较短的DNA或RNA片段上，其中mRNA的表达水平随着个体病理生理变化而变化，更能实时反映出患者当前的疾病状态和发生发展趋势。
[0004]本课题组研究发现VSIG4在肝衰竭发生、发展和转归等不同阶段过程中发挥着重要作用，参与肝衰竭疾病进展及转归的核心功能，如与免疫、凋亡和代谢等多个生物学途径密切相关。并发现，VSIG4在肝衰竭短期转归不良(死亡)患者中呈高表达水平，并与肝衰竭短期转归良好(存活)患者的表达水平存在显著差异。因此，VSIG4可以作为一种肝衰竭疾病转归预警预测的特异性指标，具有潜在的应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决现有技术存在的技术问题之一。为此，提供了一种具有良好的预后评价价值的肝衰竭分子标志物VSIG4，以及定量检测VSIG4的试剂盒能够用于肝衰竭疾病转归早期预警预测。
[0006]为了实现上述目的，对肝衰竭患者的临床样本(外周血单个核细胞)进行了高通量转录组测序，并与疾病转归(死亡、存活)的相关性进行了分析。结果发现，VSIG4在肝衰竭短期转归不良(死亡)患者中呈高表达水平，并与肝衰竭短期转归良好(存活)患者的表达水平
存在显著差异。并通过实时荧光定量PCR(qRT
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PCR)方法验证了VSIG4分子在肝衰竭疾病不同转归(死亡、存活)患者中表达水平存在显著差异，可作为肝衰竭疾病转归的预后评价的分子标志物。本专利技术提供了具有良好的预后评价价值的肝衰竭分子标志物，所述标志物包含VSIG4分子,其特异性实时荧光定量PCR引物对序列如下所示：
[0007]SEQ ID NO.1：前引物TCCTGGAAGTGCCAGAGAGT；
[0008]SEQ ID NO.2:后引物CTTTGCCTGCTGGATATGGT；
[0009]本专利技术采用的技术方案如下：
[0010]本专利技术公开了生物标志物VSIG4分子在制备肝衰竭转归预后试剂中的应用。
[0011]作为进一步地改进，本专利技术所述的预后包括预测肝衰竭患者短期的存活、死亡情况。
[0012]作为进一步地改进，本专利技术所述试剂通过检测细胞、组织或体液等临床样本中所述的肝衰竭转归预后VSIG4分子标志物的含量，来判断肝衰竭转归预后效果。
[0013]作为进一步地改进，本专利技术所述试剂通过测序、qRT
‑
PCR对VSIG4分子在细胞、组织或体液临床样本中的表达量进行定量检测。
[0014]本专利技术还公开了一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒，试剂盒包含用于检测VSIG4分子表达量的检测试剂。
[0015]作为进一步地改进，本专利技术所述检测试剂为实时荧光定量PCR引物。序列如SEQ ID NO.1所示的前引物和如SEQ ID NO.2所示的后引物；还包括与VSIG4分子表达量相关的阈值为15，还包括与VSIG4分子表达量相关的阈值为15。
[0016]作为进一步地改进，本专利技术所述的试剂盒预测肝衰竭预后的步骤如下：
[0017]1)患者试剂盒检测细胞、组织或体液等临床样本中VSIG4分子表达量；
[0018]2)当检测到的VSIG4分子表达量大于15时，患者被预测为短期死亡的高危人群。
[0019]作为进一步地改进，本专利技术所述检测试剂包含：
[0020]1)如SEQ ID NO.1前引物和SEQ ID NO.2后引物所示的用于扩增VSIG4的引物对；和/或
[0021]2)对mRNA进行反转录的试剂及对反转录产物进行特异性PCR扩增的试剂，包含：2.5U/μLPolyA聚合酶、逆转录酶、5
×
逆转录缓冲液、去RNA酶水；和/或
[0022]3)如SEQ ID.NO.3前引物和SEQ ID NO.4后引物所示的内参引物对；和/或
[0023]4)完成PCR实验所需的必要溶剂和完成PCR实验所需的扩增核酸和完成RNA抽提的试剂，包含：2
×
qPCR混合液、血清裂解液、70％乙醇、氯仿、漂洗液、无水乙醇。
[0024]本专利技术还公开了一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒的应用方法，包括：
[0025]1)所需检测样本，进行RNA提取；
[0026]2)将RNA样本1ng
‑
100μg与逆转录酶0.01
‑
10μL，RT混合液0.01
‑
10μL混合后进行反转录；
[0027]3)所得产物cDNA与0.2μL PolyA聚合酶0.01
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10μL、qPCR混合液0.01
‑
100μL充分混匀后进行PCR扩增。
[0028]作为进一步地改进，本专利技术所述的PCR扩增的条件为:检测样本提取RNA、逆转录酶0.01
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10μL、RT混合液0.01
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10μL、PolyA聚合酶0.01
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10μL、qPCR混合液0.01
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100μL；所述疾病的检测样本为细胞样本、组织样本或体液样本。疾病检测细胞样本为外周血单个核细胞
样本；疾病检测组织样本为肝组织样本；所述疾病检测体液样本优选为血液样本，所述疾病检测血液样本为血清样本或血浆样本。
[0029]本专利技术提供了肝衰竭疾病转归的预后标志物VSIG4及其应用，包含VSIG4检测试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.生物标志物VSIG4分子在制备肝衰竭转归预后试剂中的应用。2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的预后包括预测肝衰竭患者短期的存活、死亡情况。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂通过检测细胞、组织或体液等临床样本中所述的肝衰竭转归预后VSIG4分子标志物的含量，来判断肝衰竭转归预后效果。4.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述试剂通过测序、qRT
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PCR对VSIG4分子在细胞、组织或体液临床样本中的表达量进行定量检测。5.一种用于肝衰竭疾病转归预后评价的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测VSIG4分子表达量的检测试剂。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂为实时荧光定量PCR引物，序列如SEQ ID NO.1所示的前引物和如SEQ ID NO.2所示的后引物；所述的VSIG4分子表达量相关的阈值为15。7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒预测肝衰竭预后的步骤如下：1)患者试剂盒检测细胞、组织或体液等临床样本中VSIG4分子表达量；2)当检测到的VSIG4分子表达量大于15时，患者被预测为短期死亡的高危人群。8.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包含：1)如SEQ ID NO.1前引物和SEQ ID NO.2后引物所示的用于扩增VSIG4的引物对；和/或2)对mRNA进行反转录的试剂及对反转录产物进行特...

【专利技术属性】
技术研发人员：李君，梁茜，江静，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：