四引物法鉴定MTHFRC677T基因多态性试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及试剂盒技术领域，本发明专利技术公开了四引物法鉴定MTHFRC677T基因多态性试剂盒，包括标本的采集、常规方法提取全血基因组、配制PCR预混液放置于PCR反应管中，实现PCR扩增、琼脂糖电泳和结果分析步骤。无需价格高昂的荧光定量PCR仪，降低使用成本；使用普通PCR试剂价格便宜，便于生产；结果可直接判读，无需特殊设备和软件，使用效果好；PCR扩增液均为预混液，只需加入DNA模板即可，操作简单可靠；试剂盒配置有预制琼脂糖凝胶，及电泳液，终端客户只需提供DNA模板即可，无需其他试剂，有效的简化操作步骤。作步骤。作步骤。

【技术实现步骤摘要】
四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性试剂盒


[0001]本专利技术涉及试剂盒
，具体为四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性试剂盒。

技术介绍

[0002]叶酸作为人体必需的一种维生素在人体内发挥非常重要的生物学作用，叶酸的缺乏可导致多种疾病如：胎儿神经管发育缺陷引发的流产、高同型半胱氨酸血症、高血压、先天性心脏病、唇腭裂等。而亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10
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methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)作为叶酸代谢通路中最重要酶类，其活性强弱直接影响到叶酸的吸收与利用，关系到血清中同型半胱氨酸的浓度以及DNA和蛋白的甲基化水平。大量研究表明MTHFR基因的多态性与酶的热稳定性和活性息息相关，尤其是C677T基因多态性，直接影响MTHFR的活性，其中TT型的酶活性仅为CC型的34％，直接影响叶酸的吸收利用。因此在进行叶酸预防及治疗疾病时，首先要进行MTHFR基因的C677T基因多态性检测，为指导合理用药提供分子基因层面的支持。
[0003]目前市场上针对MTHFR基因C677T检测的试剂盒可分为实时荧光定量法、反向点杂交法、直接测序法等方法。与本法最近接的是：上海百傲科技股份有限公司的MTHFR(C677T)基因检测试剂盒，国械注准20163402259，该方法使用的是突变PCR法扩增目的基因MTHFR(C677T)，然后将PCR产物使用特殊的杂交仪进行杂交分析，需要另外购买昂贵的杂交芯片，以及自动杂交仪，使用成本高，不适用于基层实验室。
[0004]以上方法虽然是成熟的技术，但是各有优缺点，比如荧光定量PCR法虽然是目前在临床上检验基因多态性最主要技术方法，但是其需要设计特殊的针对突变位点的特异性引物，而且还需特异结合的荧光探针,相对试剂成本较高，由于突变位点的限制对实验设计有很高的要求；方向点杂交法，相对成本较高，而且需要在基因扩增结束后进行开盖的杂交检测，存在气溶胶的污染；直接测序法对PCR产物纯度要求高，需要测序仪，其前提投入成本高，操作步骤繁琐。基于也是的原因，本专利技术提出四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性试剂盒来解决现有技术的不足。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性试剂盒，以解决上述
技术介绍
中提出的现有技术相对成本高的问题。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性试剂盒，包括以下步骤：
[0010]S1:标本的采集；
[0011]S2:常规方法提取全血基因组；
[0012]S3:配制PCR预混液放置于PCR反应管中，实现PCR扩增；
[0013]S4:琼脂糖电泳；
[0014]S5:结果分析。
[0015]优选的，所述步骤3中的预混液具体配方为10μL的2
×
rTaq、0.5μL的Fc型引物(10μmol/L)、0.5μL的RT型引物、0.5μL的Fo引物、0.5μL的Ro引物和8μL的双蒸水。
[0016]优选的，所述步骤3的具体操作方法为将2μL全血基因组DNA加入到预混液中，将PCR反应管放入ABI 2720热循环仪中进行扩增反应，扩增程序：94℃5min预变性，94℃30s
→
58℃30s
→
72℃30s，共40个循环，72℃5min。
[0017]优选的，所述步骤4中的具体操作流程为使用普通琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物片段，电泳参数为电压100V，2％琼脂糖胶浓度，在TAE电泳液中电泳。
[0018]优选的，所述步骤5中根据电泳条带大小分析结果。
[0019]优选的，所述Fc型引物的序列为GAGAAGGTGTCTGCGGGCGC，RT型引物序列为CCAAGCTGCGTGATGATGAAATAGA，Fo引物序列为TGCTGTTGGAAGGTGCAAGATCA，Ro引物序列为GGTGAGAGTGGGGTGGAGGGA。
[0020]优选的，所述电泳条带其中374bp片段必须出现为内参片段，只出现基因为185bp片段基因型为CC型；只出现235bp片段基因型为TT型；同时出现185bp片段和235bp片段，基因为CT型。
[0021](三)有益效果
[0022]与现有技术相比，本专利技术提供了四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性试剂盒，具备以下有益效果：
[0023]1、本专利技术,无需价格高昂的荧光定量PCR仪，降低使用成本；
[0024]2、本专利技术,使用普通PCR试剂价格便宜，便于生产；
[0025]3、本专利技术,结果可直接判读，无需特殊设备和软件，使用效果好；
[0026]4、本专利技术,PCR扩增液均为预混液，只需加入DNA模板即可，操作简单可靠；
[0027]5、本专利技术,试剂盒配置有预制琼脂糖凝胶，及电泳液，终端客户只需提供DNA模板即可，无需其他试剂，有效的简化操作步骤。
附图说明
[0028]图1为本专利技术操作流程图；
[0029]图2为本专利技术四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性引物种类及PCR片段大小设计图；
[0030]图3为本专利技术引物序列表；
[0031]图4为本专利技术预混液具体组分配方图；
[0032]图5为本专利技术MTHFR C677T四引物法扩增产物示意图；
[0033]图6为本专利技术MTHFR C677T四引物法扩增产物实际电泳图。
具体实施方式
[0034]为了更好地了解本专利技术的目的、结构及功能，下面结合附图，对本专利技术四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性试剂盒做进一步详细的描述。
[0035]请参阅图1
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6，本专利技术提供一种技术方案：四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性试剂盒，包括以下步骤：
[0036]S1:标本的采集；
[0037]S2:常规方法提取全血基因组，以ARMS
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PCR(amplification refractory mutation system,突变扩增系统)为技术原理，根据MTFHR(5,10
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methylenetetrahydrofolate reductase，亚甲基四氢叶酸还原酶)C677T基因多态性位点基因序列设计突变PCR引物，分别为185bp大小的C基因型片段，235bp大小的T基因型片段，以及374bp大小的内对照片段。；
[0038]S3:配制PCR预混液放置于PCR反应管中，实现PCR扩增，预混液具体配方为10μL的2
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rTaq、0.5μL的Fc型引物(10μmol/L)、0.5μL的RT型引物、0.5μL的Fo引物、0.5μL的Ro引物和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性试剂盒，包括以下步骤,其特征在于：S1:标本的采集；S2:常规方法提取全血基因组；S3:配制PCR预混液放置于PCR反应管中，实现PCR扩增；S4:琼脂糖电泳；S5:结果分析。2.根据权利要求1所述的四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性试剂盒，其特征在于：所述步骤3中的预混液具体配方为10μL的2
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rTaq、0.5μL的Fc型引物(10μmol/L)、0.5μL的RT型引物、0.5μL的Fo引物、0.5μL的Ro引物和8μL的双蒸水。3.根据权利要求1所述的四引物法鉴定MTHFR C677T基因多态性试剂盒，其特征在于：所述步骤3的具体操作方法为将2μL全血基因组DNA加入到预混液中，将PCR反应管放入ABI 2720热循环仪中进行扩增反应，扩增程序：94℃5min预变性，94℃30s
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58℃30s
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72℃30s，共40个循环，72℃5min。4.根据权利要求1所述的四引物法鉴定M...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁建龙，罗慧敏，
申请(专利权)人：弘锦川生物医疗科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：