一种用于检测X染色体失活的引物组及其制备的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域。本发明专利技术提供了一种用于检测X染色体失活的引物组及其制备的试剂盒，所述引物组包括AR基因引物对、SLITRK4基因引物对、ZDHHC15基因引物对、PCSK1N基因引物对、M1位点引物对和AMEL基因引物对。本发明专利技术的引物组灵敏度高、特异性好，制备的试剂盒中还包含用于样本性别鉴定的AMEL基因及用于酶切性能确认的M1位点，能够更有效评价检测质量。且试剂盒的成本低，使用方便，检测快速。快速。快速。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测X染色体失活的引物组及其制备的试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种用于检测X染色体失活的引物组及其制备的试剂盒。

技术介绍

[0002]在人类细胞发育早期，每个雌性细胞中的一条X染色体会失活，以补偿雄性和雌性之间X连锁基因剂量的差异。在大多数女性中，这是一个随机过程，从而导致来自母系或来自父系X染色体失活的细胞数量大致相等。当这些细胞复制时，它们会产生同样的X染色体失活的细胞。
[0003]人类X染色体含有的基因数量是Y染色体的十倍以上。由于雄性只有一条X染色体，而雌性有两条X染色体，因此可能会有人认为雌性能产生两倍的蛋白质。但是研究表明，由于X染色体会失活的存在，导致细胞重雄性和雌性X染色体蛋白质的数量相当。
[0004]但是，如果这种失活的现象不是随机的，那就称之为偏倚失活(skewedX chromosome inactivation)。偏倚失活通常意味着有80％或者以上的细胞失活同一条X染色体。X染色体还存在着另一种特殊现象就是逃逸失活(escape from Xchromosome inactivation，XCIE)。一些女性的其中一条X染色体上，有大概四分之三的基因是沉默了的，但剩下四分之一的基因跟常染色体一样保持两条X染色体的活性。
[0005]在X染色体上大约有一千多个基因序列，在全部人类基因组中的比例占到了百分之五，对人类的影响程度相对较高。现已证实，偏倚失活(skewedX chromosome inactivation)和许多疾病有密切相关性，比如SHAM综合征(severe haemophiliaAandmoyamoya)，视网膜发育疾病，卵巢癌，及其它一些免疫缺陷的综合症。Probst通过研究X染色体上的相关基因丢失且X染色体倾斜性失活的女性，患者同时有脆性X综合征和Hunter综合征。说明在X染色体倾斜性失活的女性中将大大提升其患有神经系统疾病的概率。
[0006]DNA甲基化对维持X染色体失活状态起重要作用。失活的X染色体上常有不同形式的甲基化，特别是启动子和富集CG的CpG岛，甲基化使其转录受到抑制，而活性X染色体上则无甲基化状态。由于甲基化敏感性限制性内切酶对在甲基化酶切位点中含有甲基化碱基的区域不能进行切割，因此基于活性X染色体和失活X染色体的这一差异特点分析X染色体失活情况。目前通常使用AR基因的动态突变进行甲基化状态检测。位于X染色体q11
‑
12的AR基因的第一外显子区有一个高度多态性的三碱基短片段重复序列(CAG)n，重复次数为8
‑
31次，多态性高达88.8％。同时在此STR上游约100bp处有两个甲基化敏感特异性内切酶HpaⅡ位点，在有活性的X染色体上该位点为非甲基化状态，反之在失活的X染色体上该位点为高甲基化状态。但是单纯使用AR基因STR基因座的检测通常有10％的可能由于STR基因座为纯合基因座，导致检测结果无法判读。同时有文章提出可以对SLITRK4、ZDHHC15、PCSK1N、DXS6673E等位点进行检测，以判别X染色体失活情况，但是目前尚无一种复合检测手段，用于一次性检测多个基因座的。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种用于检测X染色体失活的引物组及其制备的试剂盒，提高X染色体失活检测方法的特异性和敏感性。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了一种用于检测X染色体失活的引物组，包括AR基因引物对、SLITRK4基因引物对、ZDHHC15基因引物对和PCSK1N基因引物对；
[0010]所述AR基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0011]所述AR基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0012]所述SLITRK4基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0013]所述SLITRK4基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0014]所述ZDHHC15基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
[0015]所述ZDHHC15基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0016]所述PCSK1N基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
[0017]所述PCSK1N基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0018]本专利技术还提供了所述的引物组在制备检测X染色体失活的试剂盒中的应用。
[0019]本专利技术还提供了一种检测X染色体失活的试剂盒，包括如下组分：甲基化敏感性限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶消化反应液、AR基因引物对、SLITRK4基因引物对、ZDHHC15基因引物对、PCSK1N基因引物对、M1位点引物对和AMEL基因引物对；
[0020]所述M1位点的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
[0021]所述M1位点的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
[0022]所述AMEL基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
[0023]所述AMEL基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0024]作为优选，所述试剂盒中AR基因引物对、LITRK4基因引物对、ZDHHC15基因引物对、PCSK1N基因引物对、M1位点引物对和AMEL基因引物对的摩尔比为1.8～2.2：0.8～1.2：0.7～0.9：0.8～1.2：0.6～0.8：0.8～1.2。
[0025]本专利技术提供了一种用于检测X染色体失活的引物组及其制备的试剂盒，所述引物组包括AR基因引物对、SLITRK4基因引物对、ZDHHC15基因引物对、PCSK1N基因引物对、M1位点引物对和AMEL基因引物对。本专利技术的引物组灵敏度高、特异性好，制备的试剂盒中还包含用于样本性别鉴定的AMEL基因及用于酶切性能确认的M1位点，能够更有效评价检测质量。且试剂盒的成本低，使用方便，检测快速。
附图说明
[0026]图1为Figure 1非甲基化组检测结果；
[0027]图2为Figure 2甲基化酶切组检测结果。
具体实施方式
[0028]本专利技术提供了一种用于检测X染色体失活的引物组，包括AR基因引物对、SLITRK4基因引物对、ZDHHC15基因引物对和PCSK1N基因引物对；
[0029]所述AR基因引物对包括：
[0030]AR
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F：FAM
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GCGCGAAGTGATCCAGAACC；
[0031]AR
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R：TGTGAAGGTTGCTGTTCCTC；
[0032]所述SLITRK4基因引物对包括：
[0033]SLITRK4
‑
F：FAM
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测X染色体失活的引物组，其特征在于，包括AR基因引物对、SLITRK4基因引物对、ZDHHC15基因引物对和PCSK1N基因引物对；所述AR基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AR基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述SLITRK4基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SLITRK4基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述ZDHHC15基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述ZDHHC15基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PCSK1N基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述PCSK1N基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。2.权利要求1所述的引物组在制备检测X染色体失活的试剂盒中的应用。3.一种含有权利要求1中引物组...

【专利技术属性】
技术研发人员：范嘉庚，李兴盛，刘丹哪，马赛勇，吴志强，
申请(专利权)人：杭州祥音医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：