非天然短链核苷酸及其在重组生物中的应用制造技术

本发明专利技术提供的非天然短链核苷酸，其核苷酸序列选自于SEQ ID NO：1

【技术实现步骤摘要】
非天然短链核苷酸及其在重组生物中的应用


[0001]本专利技术公开了一种利用非天然短链核苷酸，改造生物基因组，从而改变特征性状的方法/本专利技术公开了多条短链核苷酸序列，以及其作为表达调控元件在工程化改造生物体基因组方面的应用。

技术介绍

[0002]生命活动的底层基础是细胞内的基因表达与蛋白翻译。通过在时序和强度水平，对上述过程进行调控，能够保证生物体的生长发育、环境响应等生命活动的有序进行。基因表达与蛋白翻译的控制基础是转录翻译分子机器和表达调控元件，其中表达调控元件主要包括启动子、终止子、5
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非翻译区和3
’
非翻译区等。通过改变表达调控元件的序列，能够改变目标基因的表达特性，进而增强或减弱重组生物的特征表型。
[0003]合成目标产物的能力，是重组生物的一个重要特征表型。利用高度遗传修饰的重组生物（细胞工厂），通过生物发酵方法高效合成大宗化学品、精细化工品、高价值天然产物等，也是生物制造的基石。精准调控合成与分解途径、转录因子等基因的表达强度，则是增强重组生物合成目标产物水平的关键基础，可通过表达调控元件的变更来实现。因此，发展表达调控元件，对于强化重组生物特征表型尤为必要。
[0004]常用的终止子、3
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非翻译区等表达调控元件，主要取自生物体自身的基因组，这些天然元件的频繁使用，会增多基因组中的重复序列，并且这些内源元件序列较长，极易造成基因组的不稳定。发展新型的非天然短核苷酸序列，是丰富表达调控元件库的有效手段；应用这些短核苷酸，则能够改变单个或多个基因的表达特性，从而重塑重组生物代谢网络，强化产物合成能力、逆境耐受等目标表型。

技术实现思路

[0005]本专利技术基于高表达基因的终止子序列，训练了一个机器学习模型，然后由模型产生了的众多序列中，进行实验验证，获得10条非天然短链核苷酸，其都能改变重组生物中基因元件的表达特性，从而强化重组生物的生长发育、产物积累、逆境耐受等特征表型。由此完成本专利技术。
[0006]本专利技术首先提供一种非天然短核苷酸，其核苷酸序列选自于SEQ ID NO：1
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10任意之一；或与其序列仅有至一个、两个或三个核苷酸不同，或与其序列同一性至少达到92%，且仍具有相同功能的非天然短核苷酸。
[0007]进一步提供所述的非天然短核苷酸在调控基因的表达特性中的应用。
[0008]本专利技术还提供所述的非天然短核苷酸的表达盒，表达载体。
[0009]本专利技术进一步提供含有所述的非天然短核苷酸的重组宿主细胞。
[0010]本专利技术尤其提供一种利用所述的非天然短核苷酸对生物体进行遗传修饰进而强化特征表型的方法，其中所产生的重组生物体中，包含至少一个拷贝（例如一个、两个、三个或更多个拷贝）的非天然短核苷酸，所述非天然短核苷酸位于待调控基因的上下游1000个核苷酸以内；更优选地，其含有两种、三种或更多种不同的所述非天然短核苷酸的组合。
[0011]具体地，所述生物体为动物、植物、微生物；进一步地，所述生物体包含但不限于真核生物，所述真核生物包含但不限于酵母菌，所述酵母菌包含但不限于解脂耶氏酵母。
[0012]优选地，所述特征表型包括但不限于重组生物的生长发育、产物积累、逆境耐受；待调控基因包含但不限于天然产物合成途径基因；所述天然产物合成途径基因包含但不限于芳香族化合物的合成基因；所述芳香族化合物的合成基因包含但不限于对香豆酸和白藜芦醇的合成途径基因；对香豆酸和白藜芦醇的合成途径基因，包含但不限于SEQ ID NO：11
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13序列所示基因之一。
[0013]进一步优选地，所述非天然短核苷酸的位置处于基因终止密码子3
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端下游1000个核苷酸以内。
[0014]更优选地，所述非天然短核苷酸的位置处于基因终止密码子3
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端下游至终止子之间。
[0015]另外优选地，所述产物包含但不限于生物大分子、细胞代谢物、大宗化学品、精细化工品、营养化学品、天然产物；优选地，所述产物的积累通过微生物发酵实现；所述生物大分子包含但不限于蛋白质、多糖、油脂分子；所述天然产物包含但不限于萜类、芳香类、生物碱类、脂肪酸类化合物；所述芳香类化合物包含但不限于对香豆酸和白藜芦醇。
[0016]本专利技术提供的非天然短链核苷酸，能够改变重组生物中基因元件的表达特性，从而强化重组生物的生长发育、产物积累、逆境耐受等特征表型，具有广泛的应用价值。
具体实施方式
[0017]下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。
[0018]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0019]下述实施例在对香豆酸、白藜芦醇含量分析中，分别以对香豆酸（北京索莱宝科技有限公司，产品目录号501
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98
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4）白藜芦醇（坛墨质检标准物质中心，产品目录号501
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0）为标准品，采用高效液相色谱法绘制标准曲线，进而定量分析测试样品中对香豆酸、白藜芦醇的含量。
[0020]实施例1：应用非天然短链核苷酸调控单基因表达特性，改变酵母合成对香豆酸的水平1）以吉布森组装的方法，将十条非天然短链核苷酸（序列见SEQ ID NO：1
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10），分别与启动子PrTefintron、酪氨酸解氨酶编码基因TAL（序列见SEQ ID NO：11）、终止子Tlip2等模块，构建10个靶向同一基因组整合位点的表达质粒。短核苷酸位于酪氨酸解氨酶基因终止密码子和终止子Tlip2中间（结构为PrTefintron
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TAL
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短核苷酸
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Tlip2），对照质粒不含短核苷酸模块。
[0021]2）将上述10个质粒和对照质粒双酶切，获得11个整合型DNA片段。
[0022]3）通过转化，将上述整合型DNA片段利用同源重组的原理整合至解脂耶氏酵母染色体的同一个中性位点上，并经基因组PCR确认，由此获得11个重组解脂耶氏酵母菌株。
[0023]4）将上述重组解脂耶氏酵母菌株接种至基础矿物盐培养液，预培养16
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18 h，以OD
600
为0.05接种至基础矿物盐培养液，培养至72 h，取100 μL培养物，加入100 μL无水乙醇，涡旋混匀后过滤，取100 μL于液相进样瓶中用于HPLC检测对香豆酸。结果见表1，说明新型的短链核苷酸的应用，影响了细胞中TAL的表达特性，进而改变了解脂耶氏酵母的对香豆酸合成能力。
[0024]表1携带非天然短链核苷酸的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非天然短核苷酸，其特征在于：其核苷酸序列选自于SEQ ID NO：1
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10任意之一；或与其序列仅有至一个、两个或三个核苷酸不同，或与其序列同一性至少达到92%，且仍具有相同功能的非天然短核苷酸。2.如权利要求1所述的非天然短核苷酸在调控基因的表达特性中的应用。3.含有如权利要求1所述的非天然短核苷酸的表达盒，表达载体。4.含有如权利要求1所述的非天然短核苷酸的重组宿主细胞。5.一种利用如权利要求1所述的非天然短核苷酸对生物体进行遗传修饰进而强化特征表型的方法，其特征在于：所产生的重组生物体中，包含至少一个拷贝（例如一个、两个、三个或更多个拷贝）的非天然短核苷酸，所述非天然短核苷酸位于待调控基因的上下游1000个核苷酸以内；优选地，其含有两种、三种或更多种不同的所述非天然短核苷酸的组合。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生物体为动物、植物、微生物；进一步地，所述生物体包含但不限于真核生物，所述真核生物包含但不限于酵母菌，所述酵母菌包含但不限于解脂耶氏酵母。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征表型包括但不...

【专利技术属性】
技术研发人员：王国坤，史智慧，吴信，印遇龙，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：