一种靶向肝癌细胞的pH/GSH双响应型纳米药物载体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种靶向肝癌细胞的pH和GSH双响应型纳米药物载体及其制备方法。采用自制的亲水性含半乳糖聚合物作为可逆加成

【技术实现步骤摘要】
一种靶向肝癌细胞的pH/GSH双响应型纳米药物载体及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种靶向肝癌细胞的pH/GSH双响应型纳米药物载体及其制备方法，利用该法可以制备得到一种具有核壳结构的高分子纳米球，进一步通过静电作用载药后可以实现在肝癌肿瘤细胞中的快速释放，是一种优良的药物定向释放载体。

技术介绍

[0002]癌症是仅次于心脏病的全球排名第二的最常见致死因素，随着经济的发展和人民生活水平的提高，癌症将超心脏病成全球首要死因。在我国，肝癌是发病率和致死率居于前位的恶性肿瘤，2020年原发性肝癌发病率占全球的45.3％，死亡率占全球47.1％。目前化疗依然是治疗恶性肿瘤的主要手段，传统的药物制剂选择性差，在治疗剂量水平下对患者的正常组织器官危害大，会带来头发和牙齿脱落、恶心呕吐、白细胞下降等毒副作用，给患者带来极大的痛苦并且治疗成功率极低。
[0003]与之相反，纳米药物载体不仅可以通过增强的渗透和滞留效应(EPR)实现抗癌药物在肿瘤组织处的富集，提高药物的利用率和局部血药浓度，还可以进一步在载体表面修饰靶向配体，实现主动靶向癌细胞的能力。对于肝癌细胞来说，半乳糖基团对细胞表面高度表达的去唾液酸糖蛋白(ASGP)受体具有良好的亲和性，是一种理想的靶向配体。常见的靶向纳米药物载体包括胶束、纳米凝胶、纳米囊、脂质体、树状大分子、聚合物
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药物偶联物等，其中刺激响应型靶向载体还能够通过感应外部环境的变化(温度、pH、光、磁场、离子强度等)或在酶的作用下实现药物在肿瘤细胞内的定点、快速释放，可以有效提高肿瘤的化学治疗水平和肿瘤患者的生存率。
[0004]肿瘤部位(pH5.8
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7.2)、细胞内涵体和溶酶体(pH4.5
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5.5)的pH都低于正常体液的pH值(7.4)，这种pH的差别使得pH响应型纳米药物载体的研究开发成为热点。除了较低的pH值外，肿瘤组织与人体正常组织相比，谷胱甘肽(GSH)的浓度较高，可达到正常组织的4倍，GSH可以使含有二硫键的药物载体分解成巯基而降解，达到迅速释放药物的目的。目前文献报道的pH响应型药物载体的释药大多是以浓度差作为驱动力的扩散方式，尽管响应速度快，但是很难做到快速释放。另外文献报道的大多数pH响应型药物载体还存在合成步骤复杂等问题(多步反应偶联药物或载药后多步纯化)。具有挤压功能的pH响应型给药系统可以突破浓度扩散限制，实现药物快速释放。我们前期报道了一种具有挤压和开关功能的pH响应型纳米药物载体(一种具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，ZL 201611218315.9)，载体的核层在pH值呈酸性的肿瘤或发炎部位会由溶胀状态迅速收缩，能够将包埋的药物迅速“挤压”出来，在肿瘤化疗领域具有很大应用潜力。但是该药物载体主要通过EPR效应在肿瘤部位富集，缺乏主动靶向功能，另外该药物载体在肿瘤细胞内也无法快速降解。
[0005]通常，尺寸小于200nm的纳米粒子可以避开网状内皮系统(RES)的识别，延长血液
循环时间。Lockman等人证明直径小于100nm的聚氰基丙烯酸酯纳米颗粒可以克服血脑屏障(Journal of Controlled Release,2003,93,271)，Feng等发现细胞对粒径为100nm的颗粒的内吞效率要高于200nm的颗粒(Pharmaceutical Research,2013,30,2512)。然而，目前文献报道的大多数纳米药物载体的直径都在200nm左右，我们前期报道了一种12
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冠醚
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4辅助的无皂乳液聚合制备粒径小于100nm的聚苯乙烯纳米球的方法(ACS Applied Nano Materials,2020,3,10787)，为制备小粒径的纳米颗粒提供了有效思路。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术采用自制的亲水性含半乳糖聚合物作为可逆加成
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断裂链转移(RAFT)反应大分子链转移剂或原子转移自由基聚合(ATRP)反应大分子引发剂，(甲基)丙烯酸叔丁酯为单体，含有二硫键的双键单体作为交联剂，在12
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冠醚
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4的辅助下，通过无皂乳液活性聚合制备得到具有核壳结构且粒径小于100nm的纳米载体，壳层聚合物链上的半乳糖基团可以主动靶向肝癌细胞，核层进一步水解后得到pH/GSH双响应型纳米药物载体(附图1)。该药物载体在pH7.4时带负电，对带正电的抗癌药物具有很高的负载率；在低pH的肿瘤细胞内，核层质子化迅速收缩，载体与药物之间静电作用消失，同时肿瘤内的GSH还原二硫键使载体快速降解，抗癌药物通过机械挤压和载体自身的降解实现快速释放，是一种对肝癌细胞化疗非常有效的pH/GSH双响应型纳米药物载体。
[0007]本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]一种靶向肝癌细胞的pH/GSH双响应型纳米药物载体及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0009](1)以含半乳糖单体作为聚合单体，采用RAFT或ATRP反应聚合制备线性聚合物，反应温度10
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100℃；反应时间为0.5
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24h；单体浓度为0.1
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10M。对于ATRP反应，单体与引发剂的摩尔比范围10:1～200:1，催化剂的加入量与引发剂相同，配体的加入量为催化剂的0.5
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3倍；对于RAFT反应，引发剂与RAFT试剂的摩尔比范围为0.05
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2.0之间。反应溶剂可为甲苯、二甲苯、藜芦醚、苯、溴苯、氯苯、二氧六环、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等有机溶剂中的一种；反应结束后，用四氢呋喃或者三氯甲烷稀释反应产物，对于ATRP反应，需要将产物通过氧化铝柱除去催化剂，得到的溶液在正己烷、环己烷或石油醚中沉淀两次，离心后，所得高分子真空干燥后进入步骤(2)；
[0010](2)将步骤(1)得到的聚合物进行酸解，利用强酸的水溶液，室温下与聚合物混合搅拌0.5
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24h，透析冻干后得到含半乳糖的亲水聚合物；
[0011](3)对于RAFT反应，需将引发剂、12
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冠醚
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4、步骤(2)得到的聚合物和去离子水在反应瓶中搅拌均匀得到水相；对于ATRP反应，应将配体、催化剂、12
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冠醚
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4、步骤(2)得到的聚合物和去离子水在反应瓶中搅拌均匀得到水相；将(甲基)丙烯酸叔丁酯和含二硫键交联剂混合均匀得到油相；将油相和水相混合后通氮气除氧30min开始升温聚合，反应温度为40
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85℃，反应时间1
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48h，反应结束后将所得的纳米球溶液用透析袋透析24h，透析介质依次为无水乙醇和去离子水，目的是除去未参加反应的物质，然后将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有核壳结构的聚(甲基)丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉。
[0012](4)将步骤(3)所得的产品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向肝癌细胞的pH/GSH双响应型纳米药物载体及其制备方法，其特征在于步骤包括：(1)以含半乳糖单体作为聚合单体，采用RAFT或ATRP反应聚合制备线性聚合物，反应温度10
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100℃；反应时间为0.5
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24h；单体浓度为0.1
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10M。对于ATRP反应，单体与引发剂的摩尔比范围10:1
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200:1，催化剂的加入量与引发剂相同，配体的加入量为催化剂的0.5
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3倍；对于RAFT反应，引发剂与RAFT试剂的摩尔比范围为0.05
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2.0之间。反应溶剂可为甲苯、二甲苯、藜芦醚、苯、溴苯、氯苯、二氧六环、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等有机溶剂中的一种；反应结束后，用四氢呋喃或者三氯甲烷稀释反应产物，对于ATRP反应，需要将产物通过氧化铝柱除去催化剂，得到的溶液在正己烷、环己烷或石油醚中沉淀两次，离心后，所得高分子真空干燥后进入步骤(2)；(2)将步骤(1)得到的聚合物进行酸解，利用强酸的水溶液，室温下与聚合物混合搅拌0.5
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24h，透析冻干后得到含半乳糖的亲水聚合物；(3)对于RAFT反应，需将引发剂、12
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冠醚
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4、步骤(2)得到的聚合物和去离子水在反应瓶中搅拌均匀得到水相；对于ATRP反应，应将配体、催化剂、12
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冠醚
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4、步骤(2)得到的聚合物和去离子水在反应瓶中搅拌均匀得到水相；将(甲基)丙烯酸叔丁酯和含二硫键交联剂混合均匀得到油相；将油相和水相混合后通氮气除氧30min开始升温聚合，反应温度为40
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85℃，反应时间1
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48h，反应结束后将所得的纳米球溶液用透析袋透析24h，透析介质依次为无水乙醇和去离子水，目的是除去未参加反应的物质，然后将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有核壳结构的聚(甲基)丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉。(4)将步骤(3)所得的产品加入到90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应过夜脱除叔丁基保护，然后将反应混合物在去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到能够靶向肝癌细胞的pH/GSH双响应型纳米球干粉。(5)将步骤(4)所得的纳米球干粉分散在药物的pH缓冲溶液中，药物的浓度范围10
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2000μg/ml,pH缓冲液pH值范围6
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8。药物分子通过静电作用吸附到载体上，室温下混合24h后通过离心分离得到载药纳米球。2.根据权利要求1所述的靶向肝癌细胞的pH/GSH双响应型纳米药物载体及其制备方法，其特征在于，所述的含半乳糖单体为6
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O
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甲基丙烯酰基
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双丙酮
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D
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半乳糖、6
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O
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丙烯酰基
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双丙酮
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D
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半乳糖、6
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O
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甲代烯丙基
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双丙酮
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D
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半乳糖、对(双丙酮
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D
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半乳糖
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甲氧基)苯乙烯中的至少一种。3.根据权利要求2所述的靶向肝癌细胞的pH/GSH双响应型纳米药物载体及其制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的RAFT反应体系中，RAFT试剂为4
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氰基
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(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(CPADB)、2
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氰基
‑2‑
丙基苯并二硫(CPDB)、4
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氰基
‑4‑
(十二烷基三硫代碳酸酯基)戊酸(CDPT)、4
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【专利技术属性】
技术研发人员：曲剑波，张雪飞，隋新艺，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：