一种AraC突变体的双重筛选系统、AraC突变体的筛选方法技术方案

本申请属于突变体筛选技术领域，尤其涉及一种筛选AraC突变体及其诱导分子的方法。根据AraC诱导原理，利用毒性基因设计了含有阿拉伯糖启动子、AraC基因和毒性基因的质粒，利用毒性基因经过阿拉伯糖重复诱导多次，去除无活性的AraC突变体以及无突变的AraC。根据卡拉霉素抗性原理，设计阿拉伯糖启动子、AraC基因和卡那霉素基因的质粒，添加卡那霉素和特定的诱导分子，不断诱导富集，响应诱导分子的AraC突变体活性越高，其表现卡拉霉素抗性越高，即能筛选得到响应该诱导分子的AraC突变体。本申请有效解决现有技术筛选操纵子模型方法中存在的依靠大型仪器、操作复杂、成本高的技术缺陷。成本高的技术缺陷。

【技术实现步骤摘要】
一种AraC突变体的双重筛选系统、AraC突变体的筛选方法


[0001]本申请属于突变体筛选
，尤其涉及一种AraC突变体的双重筛选系统、AraC突变体的筛选方法。

技术介绍

[0002]在大肠杆菌中，L
‑
阿拉伯糖的代谢是由araB、araA和araD基因所编码的三种酶催化组成，它们形成一个基因簇，简写为araBAD，当有L
‑
阿拉伯糖存在时，阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白(AraC)与其诱导物L
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阿拉伯糖结合形成复合体从而诱导表达，当L
‑
阿拉伯糖不存在时，或者存在葡萄糖时，表现为阻遏，不表达。
[0003]常见的经典操纵子模型涉及阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、四环素操纵子模型等等，它们具有良好的诱导调控性能，被广泛的应用于生物
，但是随着合成生物学的兴起，目前的操纵子模型已经无法满足行业的需求，如代谢途径复杂、难以合成、产量低、成本高等等，开发响应其它小分子的操纵子则有利于解决这一难题。目前，定向进化广泛应用于小分子的改造，一般步骤主要包括突变文库的构建、突变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种AraC突变体的双重筛选系统，其特征在于，包括：第一轮筛选质粒和第二轮筛选质粒；所述第一轮筛选质粒为含有阿拉伯糖启动子、AraC基因和毒性基因的质粒；所述第二轮筛选质粒为含有阿拉伯糖启动子、AraC基因和卡那霉素基因的质粒。2.根据权利要求1所述的双重筛选系统，其特征在于，所述毒性基因选自ccdB、MazF、RelE、HigB、Doc和VapC中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的双重筛选系统，其特征在于，所述ccdB的具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。4.AraC突变体的筛选方法，其特征在于，包括：步骤1、构建权利要求1或2所述的双重筛选系统；构建AraC突变体文库；步骤2、以所述第一轮筛选质粒为模板，扩增得到不含有所述AraC基因的对应的第一轮筛选质粒骨架；以所述第二轮筛选质粒为模板，扩增得到不含有所述AraC基因的对应的第二轮筛选质粒骨架；步骤3、采用基因工程手段，将AraC突变体文库构建至所述第一轮筛选质粒骨架中，得到含有所述AraC突变体文库的第一筛选质粒；步骤4、将所述第一筛选质粒转化至宿主菌中，加入阿拉伯糖，所述阿拉伯糖诱导所述宿主菌表达所述毒性基因，所述毒性基因表达的毒性蛋白用于去除含有AraC非突变体的宿主菌，以及去除含有无活性AraC突变体的宿主菌；不响应所述阿拉伯糖诱导的且有活性AraC突变体的宿主菌存活；步骤5、从所述有活性AraC突变体的宿主菌中获得AraC突变体的核苷酸片段；步骤6、将所述AraC突变体的核苷酸片段构建至所述第二轮筛选质粒骨架中...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡玉成，江翱，吴奕瑞，刘丽花，罗元廷，
申请(专利权)人：广州市乾相生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：