高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法及应用，重组菌是根据四氢嘧啶的生物合成途径，平衡磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸和丙酮酸的碳代谢流分配构建出的以葡萄糖为底物直接发酵生产四氢嘧啶的重组菌株，在常规发酵条件下，56小时发酵液中能够积累36

【技术实现步骤摘要】
高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法及其应用


[0001]本专利技术具体涉及高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法及其应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]四氢嘧啶属于杂环氨基酸，是一种极性、易溶且生理pH范围内不带电荷的相容性溶质，能够稳定细胞膨胀压力但不影响细胞正常生理功能。由于四氢嘧啶易于在蛋白质表面形成水化层，可以缓解高渗、高温、冻融、干燥、辐射和化学试剂对DNA双螺旋结构和蛋白质、生物膜及整个细胞的毒害作用，能够稳定细胞膨胀压力但不影响细胞正常生理功能，是微生物细胞的能源物质、渗透压调节物质和细胞及大分子物质的生物保护剂，因此，在化妆品、生物技术和医药行业等领域应用广泛。
[0003]四氢嘧啶的生产方法是微生物发酵法和细胞转化法。目前，发酵法主要是以葡萄糖为底物利用嗜盐微生物采用“细菌挤奶”工艺进行生产，通过高盐诱导合成、低盐刺激促进释放，渗透压多次循环冲击实现四氢嘧啶的胞内积累和分泌。“细菌挤奶法”虽然可以获得较高的产量，但复杂的工艺流程对生产设备的要求高，高盐浓度的培养基不仅会腐蚀设备而且会增加下游纯化的难度，导致生产成本居高不下。细胞转化法是以L
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天冬氨酸盐和甘油为底物利用重组微生物或者静息细胞进行催化合成，然而以L
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天冬氨酸盐为底物，虽然避免了“细菌挤奶法”的一些弊端，但由于四氢嘧啶的生物合成过程中需要大量谷氨酸和乙酰辅酶A作为辅因子，细胞转化法得率低，生产成本较高。利用大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌在低盐条件下发酵葡萄糖合成四氢嘧啶，由于代谢途径长，碳代谢流分配不均，碳原子经济性差，产量不高，严重制约了重组菌用于发酵葡萄糖生产四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用。因此，构建新型的四氢嘧啶高产菌株，平衡葡萄糖的碳流分配，提高碳原子经济性，降低生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义，同时也是生产四氢嘧啶的重要研究方向。
[0004]专利号为ZL201510410080.2的中国专利公开了一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用，具体公开了利用lysA、thrA、iclR三个基因缺陷的大肠杆菌表达来源于伸长盐单胞菌ectABC基因簇，并利用lac启动子强化谷氨酸棒状杆菌lysC基因的表达，trc启动子增强ppc基因的表达，但是重组菌发酵 20
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28h后，四氢嘧啶产量为12
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18g/L；公开号为CN109182236A的中国专利公开了一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用，具体公开了重组大肠杆菌是将大肠杆菌E.coli MG1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因敲出，并导入核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示四氢嘧啶合成基因簇ectABC获得的，并将重组大肠杆菌应用在转化合成四氢嘧啶中，以L
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天冬氨酸钠为底物，生物转化制备四氢嘧啶，但是利用该专利的基因重组构建大肠杆菌，进行四氢嘧啶合成的最高转化率仅为35％。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，并将其应
用在四氢嘧啶的生产中，能够实现四氢嘧啶的高产量、高转化率、低成本且生产工艺简单，为后续工业化生产四氢嘧啶奠定基础。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术目的之一在于提供高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，将二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因通过重组载体导入受体菌得到高产四氢嘧啶的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌；
[0008]所述二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.1 的蛋白质或者在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有二氨基丁酸氨基转移酶活性的衍生的蛋白质；
[0009]所述二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.2 的蛋白质或者在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有二氨基丁酸乙酰基转移酶活性的衍生的蛋白质；
[0010]所述四氢嘧啶合成酶(EctC)基因编码氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质或者在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有四氢嘧啶合成酶活性的衍生的蛋白质；
[0011]进一步的，所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行下述d1和d2中任一种基因改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体：
[0012]d1、将丙酮酸激酶I基因pykF敲除，该改造以“ΔpykF”表示；
[0013]d2、将丙酮酸激酶II基因pykA敲除，该改造以“ΔpykA”表示。
[0014]进一步的，所述丙酮酸激酶I基因编码氨基酸序列SEQ ID No.4所示的蛋白质；所述丙酮酸激酶II基因编码氨基酸序列SEQ ID No.5所示的蛋白质；
[0015]其中，所述丙酮酸激酶I基因为d11
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d13中的任一种DNA分子：
[0016]d11、其编码序列是SEQ ID No.10的cDNA分子或基因组DNA；
[0017]d12、在严格条件下与d11限定的DNA分子杂交且编码所述丙酮酸激酶I 的cDNA分子或基因组DNA；
[0018]d13、与d11或d12限定的DNA分子具有90％或90％以上同一性且编码所述丙酮酸激酶I的cDNA分子或基因组DNA；
[0019]所述丙酮酸激酶II基因为d21
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d23中的任一种DNA分子：
[0020]d21、其编码序列是SEQ ID No.14的cDNA分子或基因组DNA；
[0021]d22、在严格条件下与d21限定的DNA分子杂交且编码所述丙酮酸激酶II 的cDNA分子或基因组DNA；
[0022]d23、与d21或d22限定的DNA分子具有90％或90％以上同一性且编码所述丙酮酸激酶II的cDNA分子或基因组DNA；
[0023]进一步的，所述突变型大肠杆菌还为对野生型大肠杆菌进行下述d3、d4和 d5中任一种基因改造或任意两种基因改造集合得到的所述野生型大肠杆菌的突变体：
[0024]d3、将L
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天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因thrA截短得到保留 L
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天冬氨酸激酶活性的突变体I基因(thrA*)，该改造以“ΔthrA*”表示；
[0025]d4、将二氨基庚二酸脱羧酶基因lysA替换为谷氨酸脱氢酶基因gdhA，该改造以“Δ
lysA::gdhA”表示；
[0026]d5、将L
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天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因metL截短得保留 L
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天冬氨酸激酶活性的突变体II基因(metL
*
)，该改造以“Δm本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，其特征在于：将二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因通过重组载体导入受体菌得到用于产四氢嘧啶的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌；所述二氨基丁酸氨基转移酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质或者由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有二氨基丁酸氨基转移酶活性的衍生蛋白；所述二氨基丁酸乙酰基转移酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.2的蛋白质或者由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有二氨基丁酸乙酰基转移酶活性的衍生蛋白；所述四氢嘧啶合成酶基因编码氨基酸序列为SEQ ID No.3的蛋白质或者由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有四氢嘧啶合成酶活性的衍生蛋白。2.如权利要求1所述的高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，其特征在于：所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行下述d1和d2中任一种基因改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体：d1、将丙酮酸激酶I基因pykF敲除；d2、将丙酮酸激酶II基因pykA敲除。3.如权利要求2所述的高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，其特征在于：所述突变型大肠杆菌还为对野生型大肠杆菌进行下述d3、d4和d5中任一种基因改造或任意两种基因改造集合得到的所述野生型大肠杆菌的突变体：d3、将L
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天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶I基因截短得到保留L
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天冬氨酸激酶活性的突变体I基因；d4、将二氨基庚二酸脱羧酶基因替换为谷氨酸脱氢酶基因；d5、将L
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天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶II基因截短得到保留L
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天冬氨酸激酶活性的突变体II基因。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：柯崇榕，黄建忠，杨欣伟，韩剑，丁灵涛，陈永涛，陶勇，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：