一种测定线粒体粘度的近红外双光子荧光探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种测定线粒体粘度的近红外双光子荧光探针及其应用，其中近红外双光子荧光探针的结构如下： 本发明专利技术测定线粒体粘度的近红外双光子荧光探针，在体外实验中表现出对粘度的良好响应性。细胞毒性测试表明该荧光探针的较低的生物毒性，双光子共聚焦荧光显微成像实验表明该荧光探针可以有效定位细胞中的线粒体(定位系数为0.93)，适用于细胞内的双光子荧光成像和检测。胞内的双光子荧光成像和检测。胞内的双光子荧光成像和检测。

【技术实现步骤摘要】
一种测定线粒体粘度的近红外双光子荧光探针及其应用


[0001]本专利技术涉及一种测定线粒体粘度的近红外双光子荧光探针及其应用，以实现双光子荧光成像检测细胞线粒体内的粘度变化，具有高选择性、高灵敏度、低生物毒性的优点。

技术介绍

[0002]线粒体是高度动态的细胞器，在细胞分化、细胞信息传递、细胞生长和细胞调节中发挥重要作用。功能失调的线粒体异常堆积会导致多种疾病，如心血管疾病、神经系统综合征、糖尿病、癌症等。为了维持正确的细胞功能，细胞已经开发出微调机制来监督线粒体的质量和数量。此外，线粒体自噬被认为是消除受损和有害线粒体的有效过程。因此，监测线粒体自噬对线粒体相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。
[0003]自噬是一个重要的代谢过程，通过清除聚集的蛋白质、长寿命的胞质蛋白质和受损的细胞器来维持细胞内环境稳定。它涉及一系列事件，包括双膜形成、伸长、囊泡成熟以及最终将封装的物质输送到溶酶体。自噬已被证实与多种疾病有关，如神经退行性疾病、肥胖症和癌症，自噬被认为是疾病治疗的潜在目标。因此，监测自噬以评估某些病理过程中的细胞状态或筛选与自噬相关的有效治疗性化疗药物具有重要的指导价值。
[0004]与其他生物分析方法相比，小分子荧光探针逐渐受到研究人员的青睐，由于其体积小，易于化学修饰，已成为生物系统研究的有力工具。到目前为止，基于分子转子的小分子荧光探针仍然是粘度成像的主流工具。在粘度较低的环境下，分子转子的转动基本不受抑制，激发态电子的能量主要通过非辐射跃迁的方式释放，因此其荧光强度较弱。然而，在粘度较高的环境下，由于分子转子的转动受到有效抑制，激发态电子的能量主要是以辐射跃迁的方式释放，因此荧光强度增强。利用这种与粘度相关的特性，可以开发和设计用于监测线粒体粘度变化的优异荧光探针。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在提供一种测定线粒体粘度的近红外双光子荧光探针及其应用，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种可以特异性靶向线粒体，且具有粘度响应的有机小分子结构，以实现通过双光子荧光成像实时监测活细胞线粒体内粘度的变化，具有选择性高、灵敏度高等优点，细胞毒性测试表明本专利技术双光子荧光探针的细胞相容性良好。
[0006]本专利技术近红外双光子荧光探针，简记为Mito
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CZJ，以咔唑为母体，其结构式如下所示：
[0007][0008]本专利技术近红外双光子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0009]步骤1：将KOH(340.58mmol，19.11g)溶解在丙酮(250mL)中，室温下搅拌20min，然后将3
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碘咔唑(68.26mmol，20.00g)添加到上述溶液中，室温下搅拌3h，随后将含有溴乙烷(204.77mmol，22.32g)的丙酮(50mL)溶液逐滴滴入至上述溶液中，室温下搅拌，TLC监测3
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碘咔唑反应完毕后，减压浓缩除去大部分的丙酮溶剂，加入饱和食盐水与乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后，加入硅胶粉减压蒸馏制样，石油醚：乙酸乙酯＝20:1(V/V)作为洗脱剂，过柱纯化得到化合物1，产率约为91％。
[0010]步骤2：将POCl3(123.91mmol，19.00g)逐滴加入至冰盐浴下的DMF(156.16mmol，11.40g)中，冰盐浴下搅拌15min，形成冻盐，随后将溶解在1,2
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二氯乙烷中的化合物1(15.58mmol，5.00g)加入至冻盐中，温度升至95℃回流搅拌，TLC监测化合物1反应完全后，将反应液倒入冰水中并加入10％的氢氧化钠溶液调节pH至弱碱性(pH＝9)，再加入二氯甲烷与饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后，加入硅胶粉减压蒸馏制样，石油醚：乙酸乙酯＝10:1(V/V)作为洗脱剂，过柱纯化得到化合物2，产率约为89％。
[0011]步骤3：将化合物2(2.87mmol，1.00g)溶解在适量的乙腈中，随后依次加入醋酸钯(0.29mmol，64.18mg)、三(邻甲基苯基)磷(1.44mmol，436.24mg)、碳酸钾(28.65mmol，3.95g)，充入氩气，在氩气保护下将溶解在适量乙腈中的4
‑
乙烯基吡啶(14.33mmol，1.51g)加入体系中，温度升至85℃回流搅拌3.5h；反应结束后，过滤掉剩余的碳酸钾和醋酸钯，在滤液中加入硅胶粉减压蒸馏制样，石油醚：乙酸乙酯＝2:1(V/V)作为洗脱剂，过柱纯化得到化合物3，产率约为82％。
[0012]步骤4：将化合物3
‑
甲醛
‑6‑
(4
‑
乙烯基吡啶)
‑9‑
乙基咔唑(2.06mmol，1.00g)溶解在适量的THF中，随后加入三乙胺(15.31mmol，1.55g)，再加入溶解在适量THF中的化合物6(9.19mmol，3.83g)，室温下搅拌，TLC监测化合物3
‑
甲醛
‑6‑
(4
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乙烯基吡啶)
‑9‑
乙基咔唑反应完全后，加入硅胶粉减压蒸馏制样，石油醚：乙酸乙酯＝1:1(V/V)作为洗脱剂，过柱纯化得到化合物4，产率约为85％。
[0013]步骤5：将化合物4(0.9mmol，500.00mg)溶解在适量的THF中，随后加入溶解在适量THF中的碘甲烷(9.00mmol,1277.45mg)，室温下搅拌过夜，随后进行抽滤，并用石油醚洗涤滤饼，真空烘干，即得化合物Mito
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CZJ，产率约为87％。
[0014]本专利技术近红外双光子荧光探针的的合成路线如下所示：
[0015][0016]本专利技术近红外双光子荧光探针的应用，是在活细胞线粒体的检测过程中作为检测试剂使用。
[0017]进一步地，所述检测试剂可以特异性靶向线粒体，且对活细胞线粒体具有粘度响应性，以实现通过双光子荧光成像实时监测活细胞线粒体内粘度的变化。
[0018]检测方法如下：
[0019]将本专利技术Mito
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CZJ溶于DMSO(5mL)中制得2mM的母液，取15μLMito
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CZJ母液加入到3mL不同配比的水/甘油体系混合溶剂中，得到最终浓度为10μM的测试液。Mito
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CZJ的单光子激发波长为530nm，检测600
‑
700nm范围内的荧光光谱变化，可以明显观察到650nm处荧光发射波长的强度随着溶剂粘度的增加而增加(粘度由水的粘度1.005cP增至1499cP甘油的粘度)，最高粘度时的荧光强度约为粘度最低时荧光强度的16倍，溶液粘度和荧光强度呈现良好的线性关系(R2＝0.98)。
[0020]本专利技术还探究了Mito
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CZJ在不同粘度溶液中的荧光寿命变化来考察探针的灵敏度，因为荧光寿命与探针浓度、吸收和激发强度无关，在准确判断微粘度方面具有天然的优势。荧光寿命也可以用来检测粘度的变化，比荧光强度具有更好的性能。随着粘度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种近红外双光子荧光探针，简记为Mito
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CZJ，其特征在于其结构式如下所示：2.一种权利要求1所述的近红外双光子荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：将KOH溶解在丙酮中，室温下搅拌分散均匀，然后加入3
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碘咔唑，室温下搅拌3h，随后将含有溴乙烷的丙酮溶液滴加至上述溶液中，室温下搅拌，TLC监测3
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碘咔唑反应完毕后，减压浓缩除去大部分的丙酮溶剂，加入饱和食盐水与乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后，色谱柱分离纯化得到化合物1；步骤2：将POCl3滴加至冰盐浴下的DMF中，冰盐浴下搅拌15min，形成冻盐，随后将溶解在1,2
‑
二氯乙烷中的化合物1加入至冻盐中，温度升至95℃回流搅拌，TLC监测化合物1反应完全后，将反应液倒入冰水中并加入氢氧化钠溶液调节pH至弱碱性，再加入二氯甲烷与饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后，色谱柱分离纯化得到化合物2；步骤3：将化合物2溶解在乙腈中，随后依次加入醋酸钯、三(邻甲基苯基)磷、碳酸钾，充入氩气，在氩气保护下将溶解在适量乙腈中的4
‑
乙烯基吡啶加入体系中，温度升至85℃回流搅拌3.5h；反应结束后，过滤掉剩余的碳酸钾和醋酸钯，色谱柱分离纯化得到化合物3；步骤4：将化合物3
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甲醛
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(4
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乙烯基吡啶)
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乙基咔唑溶解在THF中，随后加入三乙胺，再加...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥明，杨邦伟，赵时芸，张慧清，庞小涵，冯燕，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：