一种用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基及其应用。所述用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基可支持包括干细胞在内的各种原代细胞和细胞系的生存，并可以促进细胞分泌细胞外囊泡或外泌体；其不含血清或蛋白质，并去除了以往培养基中所使用的动物成分及植物蛋白水解物，所有组分化学成分确定，有利于细胞外囊泡或外泌体的纯化、生产批次的稳定性，从而保证和提高了细胞外囊泡或外泌体质量；其应用于在体外培养和提取细胞外囊泡或外泌体可提高细胞外囊泡或外泌体密度并提高产量，降低整体生产成本。降低整体生产成本。降低整体生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基及其应用。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡是一组异质性膜结合囊泡，其大小、载物、膜组成和生物发生不同。生物发生主要有两种机制：多泡体(multivesicular bodies,MVBs)与细胞膜融合形成外泌体；质膜出芽形成微泡(microvesicles,MVs)、核外颗粒体或微粒。细胞外囊泡也可按大小分类：外泌体大小主要为50～150nm，MVs为100～1000nm，凋亡小体为1000～5000nm。由于囊泡各亚型的大小、密度、内容物、膜取向和表面分子有重叠，现有的分离和分析方法难以有效区分。
[0003]细胞外囊泡载物具有功能性，包括遗传物质、蛋白质、脂质和可溶性介质。微RNA(miRNAs)常被研究，是一类长度约22个核苷酸的非编码RNA，可进行转录后基因调控，结合目标信使RNA(mRNAs)，影响生理过程和疾病。细胞外囊泡可作为载体保护miRNAs，防止游离miRNAs在体液中降解。除了包裹的载物，细胞外囊泡膜蛋白和脂质也通过自分泌、旁分泌和内分泌信号发挥作用。细胞外囊泡表面分子可作为受体和配体结合目标细胞外囊泡后结合特定位点，例如在受体细胞的质膜上，细胞外囊泡激活下游信号传导、胞吞或与质膜融合。细胞外囊泡的作用对许多健康和疾病状态十分重要，如缺血、炎症、疼痛、恶性肿瘤和代谢等。
[0004]目前，细胞外囊泡领域的研究逐渐进入了一个相对成熟的阶段，虽然技术依旧不够完善，但是细胞外囊泡相关研究向着更加精细化的研究方向推进。如何探索生物体或细胞在生理条件下产生的细胞外囊泡功能和作用成为了目前的一个研究热点。目前细胞培养中培养基成分来源相对复杂，如何分离特定细胞中的细胞外囊泡或外泌体就成为一个至关重要的问题。
[0005]细胞外囊泡的组成成分并不是随机的，研究表明，细胞在不同的状态分泌的细胞外囊泡内含物不同，每一个细胞外囊泡都会携带特定的分子信息，包装的独特分子构成决定了要传递给受体细胞的细胞外信号的类型，而且由一个复杂的分选系统来决定哪些分子能够进入细胞外囊泡。所以目前有两个策略来制备细胞胞培养上清用于提取细胞外囊泡。使用去除细胞外囊泡的胎牛血清培养基培养细胞和使用不含胎牛血清的培养基培养细胞(血清饥饿细胞)。但是，因后者改变了细胞的状态，目前一些高水平的研究报道使用的方法通常是前者。然而，去除细胞外囊泡的胎牛血清中仍存在游离蛋白、RNA等物质对最终结果有影响，且体系中也存在死细胞和细胞碎片，不能对细胞外囊泡进行准确定量。
[0006]成功的细胞外囊泡或外泌体提取过程中必须考虑细胞的天然特性，使得细胞能够分泌对于组织修复有利的细胞外囊泡或外泌体从而融入天然的组织结构。内稳态是维持细胞正常的生理功能的动态过程，其中包括所有与细胞生存所需的内部和外部环境。如果体外细胞培养收集细胞外囊泡或外泌体过程中，培养基成分明确不含有源蛋白或基因污染，
且不影响细胞正常生长，不会对细胞自身细胞外囊泡或外泌体表达造成干扰，由此便可得到理想的细胞外囊泡或外泌体，利于细胞外囊泡或外泌体下游应用。
[0007]因而，目前关于细胞外囊泡或外泌体提取培养基的配制仍有待深入。

技术实现思路

[0008]本专利技术的首要目的在于针对现有技术的不足，提供一种高效的、化学成分明确的、适用于细胞外囊泡或外泌体提取的培养基。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供上述培养基在体外培养和提取细胞外囊泡或外泌体的应用。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0011]一种用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基，包括以下组成成分：
[0012]渗透压调节剂0.01～5000mg/L；
[0013]缓冲剂2005～12500mg/L；
[0014]能量物质2000～20000mg/L；
[0015]金属离子添加剂0.01～500mg/L；
[0016]维生素和酶辅因子2.21～65mg/L；
[0017]脂质因子0.10～20.00mg/L；
[0018]次黄嘌呤钠(Hypoxanthine)1～200mg/L；
[0019]胸腺嘧啶核苷(Thymidine)1～100mg/L；
[0020]D
‑
泛酸钙1～100mg/L；
[0021]盐酸吡哆醛1～100mg/L；
[0022]盐酸硫胺素1～100mg/L；和
[0023]肌醇2～200mg/L；
[0024]优选包括以下组成成分：
[0025]渗透压调节剂4820.08mg/L；
[0026]缓冲剂6775.016mg/L；
[0027]能量物质5000mg/L；
[0028]金属离子添加剂0.016mg/L；
[0029]维生素和酶辅因子7.13mg/L；
[0030]氨基酸1711.2mg/L；
[0031]脂质因子1mg/L；
[0032]次黄嘌呤钠16mg/L；
[0033]胸腺嘧啶核苷4mg/L；
[0034]D
‑
泛酸钙1mg/L；
[0035]盐酸吡哆醛1mg/L；
[0036]盐酸硫胺素1mg/L；和
[0037]肌醇2mg/L。
[0038]所述的渗透压调节剂将所述用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基的渗透压浓度保持在250～350mOsm/L；优选为290～320mOsm/L。
[0039]所述的渗透压调节剂优选为NaCl、KCl和KNO3中的至少一种；更优选为4200～4800mg/LNaCl、300～340mg/LKCl和0.06～0.1mg/LKNO3；最优选为4500mg/LNaCl、320mg/LKCl和0.08mg/LKNO3。
[0040]所述的缓冲剂将所述用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基的pH值保持在5.5～7.7；优选为7.0。
[0041]所述的缓冲剂优选为NaHCO3、CaCl2·
2H2O、MgSO4·
7H2O、NaH2PO4·
2H2O和丙酮酸钠中的至少一种以及N
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
N
’‑
(2
‑
乙磺酸)(HEPES)和3
‑
(N
‑
吗啉代)
‑
丙磺酸(MOPS)中的至少一种；更优选为3000～3050mg/LNaHCO3、200～240mg/LCaCl2·
2H2O、180～220mg/LMgSO4·
7H2O、120～160mg/LNaH2PO4·
2H2O、100～103mg/L丙酮酸钠和5900～6000mg/LN
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基，其特征在于，包括以下组成成分：渗透压调节剂0.01～5000mg/L；缓冲剂2005～12500mg/L；能量物质2000～20000mg/L；金属离子0.01～500mg/L；维生素和酶辅因子2.21～65mg/L；氨基酸1170～2290mg/L；脂质因子0.10～20.00mg/L；次黄嘌呤钠1～200mg/L；胸腺嘧啶核苷1～100mg/L；D
‑
泛酸钙1～100mg/L；盐酸吡哆醛1～100mg/L；盐酸硫胺素1～100mg/L；和肌醇2～200mg/L。2.根据权利要求1所述的用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基，其特征在于，包括以下组成成分：渗透压调节剂4820.08mg/L；缓冲剂6775.016mg/L；能量物质5000mg/L；金属离子0.016mg/L；维生素和酶辅因子7.13mg/L；氨基酸1711.2mg/L；脂质因子1mg/L；次黄嘌呤钠16mg/L；胸腺嘧啶核苷4mg/L；D
‑
泛酸钙1mg/L；盐酸吡哆醛1mg/L；盐酸硫胺素1mg/L；和肌醇2mg/L。3.根据权利要求1所述的用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基，其特征在于：所述的渗透压调节剂为NaCl、KCl和KNO3中的至少一种；所述的缓冲剂为NaHCO3、CaCl2·
2H2O、MgSO4·
7H2O、NaH2PO4·
2H2O和丙酮酸钠中的至少一种以及N
‑
(2
‑
羟乙基)哌嗪
‑
N
’‑
(2
‑
乙磺酸)和3
‑
(N
‑
吗啉代)
‑
丙磺酸中的至少一种；所述的能量物质为单糖；所述的金属离子为含有镁、铜、锌、钠、钾和硒的至少一种金属离子的化合物；所述的维生素和酶辅因子为：维生素B6、维生素B12、维生素K、维生素C、维生素B2、维生素B1、烟酰胺、维生素B5、叶酸和异肌醇中的至少一种；所述的氨基酸为L
‑
丙氨酸、L
‑
精氨酸、L
‑
天冬酰胺、L
‑
天冬氨酸、L
‑
胱氨酸、L
‑
胱氨酸二钠盐、L
‑
谷氨酸、L
‑
谷氨酰胺、甘氨酸、L
‑
组氨酸、L
‑
异亮氨酸、L
‑
亮氨酸、L
‑
赖氨酸、L
‑
蛋氨
酸、L
‑
苯丙氨酸、L
‑
脯氨酸、L
‑
丝氨酸、L
‑
苏氨酸、L
‑
色氨酸、L
‑
酪氨酸、L
‑
酪氨酸二钠盐和L
‑
缬氨酸中的至少一种；所述的脂质因子为氯化胆碱、硫辛酸、油酸、磷脂酰胆碱和亚油酸甲酯中的至少一种。4.根据权利要求3所述的用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基，其特征在于：所述的能量物质为D
‑
葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖中的至少一种；所述的金属离子为亚硒酸钠。5.根据权利要求4所述的用于提取细胞外囊泡或外泌体的培养基，其特征在于：所述的渗透压调节剂为4200～4800mg/L NaCl、300～340mg/L KCl和0.06～0.1mg/...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊星亮，
申请(专利权)人：广东第二师范学院，
类型：发明
国别省市：