用于提取细胞外囊泡的试剂盒与方法技术

本发明专利技术涉及用于从生物样本中提取细胞外囊泡的试剂盒和方法。所述方法包括以下步骤：I)向含细胞外囊泡的生物样本加入比表面积不低于1000 cm2/g的高比表面积材料和能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分，孵育至少1分钟；II)将样本分离并去除上清液；和III)洗涤步骤II)后的高比表面积材料并收集附着在高比表面积材料的细胞外囊泡。本发明专利技术的方法借助常规设备就可以实现细胞外囊泡的自动化、高通量全提取，适用于所有的样本类型，可以选择性地实现样本中的细胞外囊泡的提取和/或细胞外囊泡以及游离核酸的提取。泡以及游离核酸的提取。

【技术实现步骤摘要】
用于提取细胞外囊泡的试剂盒与方法


[0001]本专利技术涉及生物
具体地，本专利技术涉及用于提取细胞外囊泡的试剂盒与方法。

技术介绍

[0002]活细胞会持续分泌细胞外囊泡(EV)。细胞外囊泡基于其生物发生、大小和生物物理性质可以进一步分类的主要类型包括外泌体(起源于内吞途径，直径约为30
‑
150nm)、微粒/微囊泡(从质膜释放，直径约为100
‑
1000nm)、凋亡小体(由细胞凋亡产生，直径约为50nm
‑
2μm)、肿瘤小泡(由肿瘤细胞释放产生，直径约为1
‑
10μm)以及其它各种细胞外囊泡亚群。
[0003]细胞外囊泡被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后相关生物标志物的重要载体。细胞外囊泡的分离方法主要有超速离心法、沉淀法、色谱法、超滤法、微流控技术以及磁珠免疫亲和法等。
[0004]微流控技术、色谱法以及磁珠免疫亲和法有望实现细胞外囊泡的自动化提取。但是色谱法提取的细胞外囊泡纯度低且不可避免的会对细胞外囊泡进行稀释，只能实现细胞外囊泡的分离，不能实现细胞外囊泡的充分富集；微流控技术本质上是对微小流体的操控技术，无法实现对临床上毫升乃至数十毫升级别的样本处理需求。
[0005]磁珠免疫亲和法是磁珠法提取细胞外囊泡中最常用的方法。该方法通过在磁珠上修饰细胞外囊泡特异性的抗体(比如CD9、CD63、CD81等抗体)，针对细胞外囊泡上的CD9、CD63、CD81等抗原，利用抗原
‑
抗体反应进行细胞外囊泡的特异性提取。但是一方面，由于抗体高昂的价格，磁珠免疫亲和法的成本非常高，不适用于大体积样本的细胞外囊泡的提取，而且磁珠免疫亲和法高昂的成本限制了它在临床和工业上的大规模使用。另一方面，目前还没有发现任何一种抗体是细胞外囊泡独有的，这使得磁珠免疫亲和法提取的不一定是细胞外囊泡，也可能是细胞碎片或者一些细胞器，影响了提取纯度。此外也不是每一个细胞外囊泡表面都有CD9、CD63、CD81等抗体，这使得很大一部分细胞外囊泡会被遗漏，影响了提取效率。
[0006]CN107254430B、US10808240B2等公开了一种针对细胞外囊泡带负电的特性、利用带正电荷的材料通过静电吸附的方法对细胞外囊泡进行提取的方法。该方法不需要特异性的抗体即可对细胞外囊泡进行非特异性提取。但是这种方法需要特殊修饰的带正电的材料才能对细胞外囊泡进行有效提取，这增加了电荷吸附法提取细胞外囊泡的成本。此外，除了细胞外囊泡，样本中还有很多的蛋白质、脂质、游离核酸等成分都是带负电的，这使得通过电荷吸附法提取的细胞外囊泡是含有很多杂质的混合物。
[0007]CN112322583A公开了一种基于凝血的细胞外囊泡提取方法，该方法利用亲水或带负电的磁珠会在血浆中激起凝血的特性，以及利用细胞外囊泡磷脂双分子分子层会参与凝血过程的特性，实现磁珠对于血浆中细胞外囊泡的提取。该方法不需要特异性的抗体即可对细胞外囊泡进行非特异性提取，降低了磁珠法提取细胞外囊泡的成本，且重复性好，提取
效率高。但是该方法只能适应于血浆样本或含有凝血成分的样本。
[0008]目前细胞外囊泡大多依赖手动提取，到目前为止世界上仅有一款新西兰Izon公司研发的qEV色谱柱搭配自动馏分收集器(AFC)可以实现细胞外囊泡的自动化提取。该设备对于细胞外囊泡的提取通量低、纯度低，提取的细胞外囊泡无法进行有效浓缩，且需要专门的配套仪器，成本高。
[0009]因此，尽管细胞外囊泡极具临床应用价值，但目前缺乏对其进行有效、廉价且工业上可行的自动化分离和富集的技术，因此细胞外囊泡在临床转化上仍有障碍。从而，本领域中对将细胞外囊泡分离与富集的方法还存在需求。

技术实现思路

[0010]本专利技术的一个目的是提供一种用于提取细胞外囊泡的方法，其成本低廉、提取效率高、可以配合常见设备，实现各种细胞外囊泡的自动化分离和提取。
[0011]本专利技术的另一个目的是提供一种用于从生物样本中提取细胞外囊泡的试剂盒，其可以用于上述方法。
[0012]因此，根据第一方面，本专利技术提供一种用于提取细胞外囊泡的试剂盒，其特征在于，包含：
[0013]i)一种比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料；和
[0014]ii)能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分。
[0015]根据第二方面，本专利技术提供一种用于从生物样本中提取细胞外囊泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0016]I)向含细胞外囊泡的生物样本加入比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料和能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分，孵育至少1分钟；
[0017]II)将样本分离并去除上清液；和
[0018]III)洗涤步骤II)后的高比表面积材料并收集附着在高比表面积材料的细胞外囊泡。
[0019]本专利技术提出一种新的细胞外囊泡捕获方法，其利用盐析和盐桥的作用，以高比表面积材料作为“种子”，在高比表面积材料上完成细胞外囊泡的吸附。本专利技术的方法不要求对高比表面积材料进行改性或修饰，使用常规材料就可以进行细胞外囊泡的提取，成本低廉、适用性广。本专利技术的方法借助常规设备就可以实现细胞外囊泡的自动化全提取，适用于所有的样本类型，可以实现工业上的高通量自动化提取或满足临床需求。本专利技术的方法可以选择性地实现样本中细胞外囊泡的提取或细胞外囊泡及游离核酸的捕获。
附图说明
[0020]下面结合附图对本专利技术进行更详细地说明和解释，其中：
[0021]图1显示了本专利技术的方法提取细胞外囊泡的原理示意图。
[0022]图2显示了本专利技术的方法与超高速离心法提取细胞外囊泡的效率以及重复性对比。
[0023]图3显示了不同磁珠对本专利技术的方法提取细胞外囊泡的影响。
[0024]图4显示了本专利技术的方法通过调节提取试剂、洗涤液的浓度从而实现对细胞外囊
泡及游离核酸、细胞外囊泡、除细胞外囊泡外的游离核酸进行选择性提取。
[0025]图5显示了本专利技术的方法通过调节提取试剂、洗涤液的浓度从而实现对细胞外囊泡及游离核酸、细胞外囊泡、除细胞外囊泡外的游离核酸进行选择性的提取后提取到的游离核酸与细胞外囊泡数量的比例。
[0026]图6显示了对利用本专利技术的方法提取的细胞外囊泡的标志性蛋白进行化学发光检测的结果。
[0027]图7显示了利用本专利技术的方法自动化提取的细胞外囊泡及其核酸的qPCR结果。
具体实施方式
[0028]现以说明的目的而非限制地描述本专利技术的一些具体实施方式。
[0029]用于提取细胞外囊泡的试剂盒
[0030]根据第一方面，本专利技术提供一种用于从生物样本中提取细胞外囊泡的试剂盒，其特征在于，包含：
[0031]i)一种比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料；和
[0032]ii)能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分。
[0033]所述高比表面积材料与所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于从生物样本中提取细胞外囊泡的试剂盒，其特征在于，包含：i)一种比表面积不低于1000cm2/g的高比表面积材料；和ii)能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括iii)用于降低杂质浓度的组分和/或iv)用于洗涤杂质的组分。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括至少两个隔室以分别容纳i)高比表面积材料、ii)能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分、任选的iii)用于降低杂质浓度的组分和任选的iv)用于洗涤杂质的组分。4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述高比表面积材料选自球状材料、类球状材料、形状不规则的颗粒或多孔膜。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述高比表面积材料选自带正电、带负电或不带电的磁珠。6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分选自亲水性高分子聚合物或其与水溶性盐的组合，优选地，亲水性高分子聚合物选自聚乙二醇(PEG)、甲基纤维素、聚乙烯亚胺及其组合，所述水溶性盐选自Al
3+
、H
+
、Ba
2+
、Sr
2+
、Ca
2+
、Cs
2+
、Rb
+
、NH
4+
、K
+
、Na
+
、Li
+
的一种或多种阳离子与选自PO43‑
、SO42‑
、CH3COO
‑
、Cl
‑
、NO3‑
、ClO4‑
、I
‑
、SCN
‑
的一种或多种阴离子形成的盐。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分以在含水载体中的悬浮液或者溶液的形式存在。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述含水载体选自纯水或者含有水的缓冲液。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述含水载体选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、TRIZMA缓冲液、Tris缓冲液和TE缓冲液。10.根据权利要求7至9中任一项所述的试剂盒，其特征在于，在所述悬浮液或溶液中，亲水性高分子聚合物的质量分数为3％
‑
60％，盐的浓度为0
‑
6M，都以所述悬浮液或溶液为基准；优选地，在所述悬浮液或溶液中，所述亲水性高分子聚合物的质量分数为10％
‑
40％，所述水溶性盐的浓度为0.5
‑
4M，都以所述悬浮液或溶液为基准。11.根据权利要求1
‑
10中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述用于降低杂质浓度的组分选自纯水和水溶液，优选地选自磷酸盐缓冲液(PBS)、氯化钠溶液Tris缓冲液、TE缓冲液和纯水。12.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述用于洗涤杂质的组分为能够调节渗透压的组分在含水载体中的悬浮液或者溶液，优选地，所述能够调节渗透压的组分为权利要求6中定义的能够使细胞外囊泡发生盐析和/或盐桥的组分。13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述含水载体选自纯水或者含有水的缓冲液。14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述含水载体选自PBS缓冲液、HEPES缓冲液、TRIZMA缓冲液、Tris缓冲液和TE缓冲液。15.根据权利要求12至14中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述用于洗涤杂质的组分中还包含表面活性剂。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的试剂盒，其特征在于，在所述用于洗涤杂质的组分中，所述高分子聚合物的质量分数为1％
‑
30％，所述盐的浓度为0
‑
3M，都以所述用于洗涤杂质的组分为基准。17.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛滔，汤华军，王秀娟，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：