具有连续外壁及支架结构可用于培养细胞的微载体制造技术

本发明专利技术关于一种具有三维支架结构用于培养细胞的微载体，其包括一个由生物兼容性高分子所组成的连续媒质。该连续媒质于微载体内部构筑一种三维支架结构可容纳多数个互相堆栈的球状巨孔，并于微载体外周表面形成一连续外壁。每个球状巨孔周围一般有多个相邻接触的球状巨孔并各别有连通孔相通。某些球状巨孔会与连续外壁相邻接触，而在连续外壁上各别形成暴露孔。经由这些暴露孔内部的支架结构可以与外界直接相通溶液。本发明专利技术的微载体经由连续媒质模铸成型而具有连续外壁，从而保有高孔隙率并维持良好机械特性。连续媒质模铸成型后实质上呈现基本几何体的构形。本发明专利技术也关于这种三维支架微载体的模铸成型方法。支架微载体的模铸成型方法。支架微载体的模铸成型方法。

【技术实现步骤摘要】
具有连续外壁及支架结构可用于培养细胞的微载体


[0001]本专利技术关于一种细胞培养装置，特别是一种含有三维支架结构可用于培养细胞的微载体，其经由模铸成型(mold casting)而具有连续外壁，从而保有高孔隙率并维持良好机械特性。本专利技术也关于这种三维支架微载体的模铸成型方法。

技术介绍

[0002]传统上，活体外细胞培养是透过使细胞附着在组织培养塑料器皿或胞外基质附着蛋白上，再给予适当的液体培养基促使其生长和增殖。然而，这种二维平面的培养方式与活体内的实际生理环境相去甚远，无法模拟活体内细胞与胞外基质以及细胞彼此之间的交互作用，亦不利于重现诸如细胞移行、凋亡、转录调节和受体表达等复杂的细胞行为。二维培养方式更局限了细胞的生长空间，不利于细胞的大量生产。三维细胞培养技术显然是响应上述产业课题的较佳解决方案。
[0003]1980年代，美国劳伦斯伯克利国家实验室的Mina Bissell博士在对乳腺癌的研究中开创了三维细胞培养的技术(请参见Petersen O.W.,et al.,PNAS,89(19):9064
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9068)，其涉及将细胞与具有三维结构的支架在活体外共同培养，使细胞在支架的三维立体空间结构中生长和移行。近年来，随着细胞支架制作工序的成熟，三维细胞培养技术逐渐取代了传统的二维平面培养技术而被广泛地应用在组织工程等生物医学领域中。在应用上，三维支架可于活体外或活体内供细胞生长、组织分化及重塑，最终产生具有实验用途或进一步供用于移植的组织。在结构上，其为具有大量微小孔洞的堆栈结构体，以供细胞接种和附着，再藉此导引细胞朝依规划的三维方向进行生长分化，产生拟似的再生组织或器官。
[0004]美国专利第8513014号叙述一种制造三维支架结构块状材的方法，其涉及使用一个气泡产生器，将气流导入基质流体中以产生尺寸均一的气泡，使气泡胶化后再减压破泡，再经固化后可制成一块具有三维支架结构的材料。美国专利早期公开案第2019/091690A1号和美国专利第10,828,635号分别叙述运用具有正交结构(T
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junction)的微流道装置来大量产生单分散性气泡的装置，以及将气泡由液体中分离出来的分离装置，促使气泡排列成最密堆积状态后再予以胶化、破泡、及固化后便能大量生产此类三维支架结构的块状材。美国专利申请案第17/184,276号叙述了一种运用高内相乳液模板工序来制作三维细胞支架的方法。其他类型的习用支架制备技术还包括盐析法(salting
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out process)、冷冻干燥法(freeze drying process)以及固体自由成型法(solid freeform fabrication process)等。
[0005]虽然上述方法已经可以制作出三维支架的块状材，但于实际应用时需考虑细胞培养过程中新鲜培养液与代谢物的扩散速率能够满足所有附着于三维支架上的细胞健康地成长。因此块状材实质上必须细分成小颗粒来使用，上述物质才能及时从微载体内部到外界之间来回进行扩散输送。由过去经验得知微载体的合适的尺寸一般可以在500微米至3000微米范围内选取。所选取的特定尺寸视所欲培养的细胞种类及培养条件而定。这个尺寸范围内的微载体在持续搅动培养液时能始终保持悬浮流动状态。
[0006]上述块状材细分成微载体的方法一般采用习知的机械高速切割。但是切割时微载体内部支架将会承受过高的瞬间机械应力，致使支架产生结构缺陷，且外表形状也因切割呈现破碎不规则，有大量的球状巨孔裸露，不具有连续整齐的外壁。于细胞培养时的搅动状态下，此种微载体因机械强度不足而容易崩解碎裂，其孔洞裸露的结构也使依附其上的细胞过度承受培养液流动时所造成的剪切力，从而导致细胞生产率低下。另外，高速切割所得的微载体尺寸分布视切割方法而定。若要求尺寸均一性高则切割制程相对繁复；所费工时甚长。若求压缩工时而简化制程，则微载体尺寸分布甚大(数微米～千微米左右)。再经由筛选取其适合培养细胞者(最大与最小尺寸的比不超过1.5倍)，经验显示其产出效益(yield)甚低。若采用另一习知技术：极短波长雷射切割。此方法仍需面对工序繁复、产品表面孔洞裸露、设备昂贵的问题。而雷射切痕耗损宽约0.1mm，设定最后微载体切割成1mm3的尺寸，其产出效益粗估等于：(1/1.1)3＝75％，结果仍有25％的耗损。因此，相关
对于具有高孔隙率但不致实质降低其机械强度的微载体及兼具低成本、低工时、低损耗的制造方法，仍然存在有高度的需求。

技术实现思路

[0007]本专利技术揭露一种具有高孔隙率及良好机械特性，具有三维支架结构且可用于培养细胞的微载体，以及该微载体的新式制程。所述的微载体采用模铸成型来制造，其涉及将一含有生物兼容性高分子的泡沫体注入适当模具中，再予以破泡、固化成型，经过脱模后即获得所述微载体。该泡沫体实质上由数目众多的气泡共存堆栈于含生物兼容性高分子的溶液中所组成。在固化后气泡所占原有空间形成球状巨孔，高分子溶液在固化后成为具有三维支架型态的连续媒质。相邻巨孔接触区因破泡过程产生连通孔。当泡沫体注入模具内而与模具表面以及外界的空气接触，由于高分子溶液的表面张力自然会形成一层溶液膜包围此泡沫体。于固化后此溶液膜成为微载体外表的连续外壁。某些球状巨孔会与连续外壁相邻接触，因破泡过程而在连续外壁上产生多个暴露孔。
[0008]因此，依据本专利技术的基本态样，其在于提供一种微载体，其尺寸可以在500微米至3000微米之间作选择，视所欲培养的细胞种类及培养条件而定。其整体外型呈现某种简单的基本几何体。其具有上述由连续媒质所构筑的三维支架、多数个互相堆栈的球状巨孔、连通孔、暴露孔以及连续外壁等形成微载体的结构特征。每个球状巨孔周围可以和多个相邻的球状巨孔接触并各别有连通孔相通。连续外壁与某些球状巨孔接触而形成暴露孔，经由该孔内部的支架结构和外界可以相通溶液。
[0009]培养液与代谢物从微载体中心到边界的扩散会经由球状巨孔、连通孔、暴露孔等结构所形成的多条曲曲折折的路径。这些结构都构成扩散瓶颈。为使扩散速率能满足微载体内的细胞成长所需，扩散瓶颈不宜过多。依据专利技术人的实证经验，如果以球状巨孔的直径作为1单位，则合宜的扩散距离约在3至5单位之间。因此，所述微载体的特征尺寸与球状巨孔的直径的比值介于约6：1至约10：1。
[0010]依据本专利技术的另一态样，其在于提供一种用于制造前述微载体的方法，其包含下列步骤：
[0011]A、制备一个高分子泡沫体(polymeric foam)，其包含一连续相，以及一与该连续相不相混溶而且由许多个散布于该连续相中的相互隔离单元构成的分散相，其中该连续相
包含选自于由生物兼容性高分子、其单体、其寡聚物和它们的组合所组成的群组的成份；
[0012]B、将该高分子泡沫体填入一个多孔平板模具中，再将该高分子泡沫体固化而得到一连续媒质，其中该多孔平板模具界定出多个连接该多孔平板模具的两个主要表面的微型通孔，且各个微型通孔被建构成具有基本几何体的构形，并且具有一介于500本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有三维支架结构用于培养细胞的微载体，其特征在于，其包含：一个由生物兼容性高分子所构成的连续媒质，其具有一实质上呈现基本几何体的构形，以及一介于500微米至3000微米的特征尺寸；其中该微载体形成有数个相互邻接的球状巨孔，而该等球状巨孔之间透过一或多个连通孔相通，其中该等球状巨孔的直径与该特征尺寸的比值介于约1：6至约1：10之间；以及其中该微载体具有一连续外壁，而该等球状巨孔与该连续外壁相接处分别形成有一暴露孔。2.如权利要求1所述的微载体，其特征在于，其中该等暴露孔的孔径实质小于与其相邻的球状巨孔的孔径。3.如权利要求2所述的微载体，其特征在于，其中该基本几何体选自于由圆柱体、球体、圆锥体、正方体、长方体、棱柱体和棱锥体所组成的群组。4.如权利要求3所述的微载体，其特征在于，其中该连续媒质具有一介于500微米至880微米的特征尺寸。5.如权利要求4所述的微载体，其特征在于，其中该生物兼容性高分子选自于由蛋白质类、多醣类、人造高分子类，以及它们的组合所组成的群组。6.如权利要求5所述的微载体，其特征在于，其中该生物兼容性高分子选自于由明胶、胶原蛋白、纤维蛋白(fibrins)、琼脂糖、玻尿酸、甲壳素、海藻酸盐、纤维素、吉兰胶(gellan gum)所组成的群组。7.如权利要求6所述的微载体，其特征在于，其中该等球状巨孔具有介于50微米至200微米的直径。8.如权利要求7所述的微载体，其特征在于，其中该连续媒质中有至少50％的球状巨孔是以最密堆积的形式排列。9.一种用于制造微载体的方法，其特征在于，其包含下列步骤：A、制备一个高分子泡沫体，其包含一连续相，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：林鹏，赵子元，陈冠齐，谢逸凡，
申请(专利权)人：台湾创新材料股份有限公司，
类型：发明
国别省市：